预习放免方法设计

预习放免方法设计

Page1前言原理第2页,共48页，2024年2月25日，星期天前言

放射免疫方法的建立原则

根据分析目的和要求，通过对标记物、抗体、标准品（校准品）的合理匹配，以及对反应条件、分离方法的选择，达到最满意的效果第3页,共48页，2024年2月25日，星期天前言

放射免疫设计的目标

根据要求使试剂的剂量反应曲线在满足灵敏度的情况下，是多数样品得到较高的精密度。第4页,共48页，2024年2月25日，星期天目录灵敏度的设计反应条件的选择反应方式的选择分离方法的选择方法学鉴定第5页,共48页，2024年2月25日，星期天灵敏度的设计第6页,共48页，2024年2月25日，星期天灵敏度的设计放射免疫分析的灵敏度Sensitivity指能测出的具有统计学意义的最小值，通常指“0”标准管结合率减两个标准差的相应剂量。第7页,共48页，2024年2月25日，星期天灵敏度的设计放射免疫分析的灵敏度Sensitivity若以能测出的具有一定精密度的最小值为灵敏度的定义，则应根据剂量反应曲线的精密度图（PDP），以CV%-10%的最小剂量为有效地可测量的最小剂量，即灵敏度。第8页,共48页，2024年2月25日，星期天灵敏度的设计放射免疫分析的灵敏度Sensitivity影响因素标记物的比活性抗体的亲和力和用量剂量反应曲线浓度范围第9页,共48页，2024年2月25日，星期天标记物的用量标记物的用量∝计数率计数误差灵敏度统计涨落样品保持一定的计数率①减少样品化学量②适当比活性、稳定的标记物第10页,共48页，2024年2月25日，星期天标记物的用量最佳标记抗原的选择方法用不同浓度的标记抗原作一系列的抗血清实验，直到标记物减少不再使曲线再右移，此时标记物浓度称“减弱浓度”，即为加入标记抗原化学量的最低浓度。第11页,共48页，2024年2月25日，星期天抗血清的用量放射免疫分析抗血清的鉴定指标高亲和力高滴度高特异性选用亲和常数大，滴度高的抗血清第12页,共48页，2024年2月25日，星期天抗血清的用量确定抗血清用量的方法第13页,共48页，2024年2月25日，星期天抗血清的用量确定抗血清用量的方法抗血清滴度曲线

B/T01020304050607080结合率为30%-50%的抗血清稀释度

第14页,共48页，2024年2月25日，星期天抗血清的用量确定抗血清用量的方法做两条抗体稀释度曲线A.单纯标记抗原B.标记抗原中加入微量非标记抗原

两条曲线分离度最大时抗体稀释度，即为最佳稀释度。考虑了标记抗原与抗原免疫活性是否一致第15页,共48页，2024年2月25日，星期天剂量反应曲线剂量反应曲线的浓度范围可影响反应曲线的斜率根据实验体系的要求以及稀释曲线确定第16页,共48页，2024年2月25日，星期天剂量反应曲线剂量反应曲线的浓度范围可影响反应曲线的斜率根据实验体系的要求以及稀释曲线确定最低标准品的浓度应与标记物的用量接近，B/B0=80-90%最大浓度剂量点的结合率为10-20%待测物的正常浓度范围应在剂量反应曲线的直线部分第17页,共48页，2024年2月25日，星期天剂量反应曲线剂量反应曲线的浓度范围第18页,共48页，2024年2月25日，星期天剂量反应曲线剂量反应曲线的工作范围工作范围由PDP图确定工作范围与剂量反应曲线的浓度范围是两个不同的概念第19页,共48页，2024年2月25日，星期天剂量反应曲线剂量反应曲线的工作范围工作范围确定方法：A.CV%<10%的剂量区段为有效工作范围第20页,共48页，2024年2月25日，星期天剂量反应曲线剂量反应曲线的工作范围工作范围确定方法：结合率（B/B0%）在20-80%之间的区段为工作范围

为剂量反应曲线接近直线的部分，待测物的正常范围应在该区段以内。

第21页,共48页，2024年2月25日，星期天反应试剂剂量关系第22页,共48页，2024年2月25日，星期天反应试剂剂量关系一般规律灵敏度增加工作范围减小第23页,共48页，2024年2月25日，星期天反应试剂剂量关系一般规律灵敏度下降工作范围较大第24页,共48页，2024年2月25日，星期天反应试剂剂量关系比较抗原浓度和抗体浓度的最佳匹配数学模型推倒

最适抗体浓度q=3/K

最适标记抗原浓度*Ag=4/K经验确定（常用于实际工作）

①通过一定量的标记抗原作抗体滴度试验，确定抗血清稀释度

②通过剂量反应曲线的制作进行逐步调整，最后达其最佳相互关系第25页,共48页，2024年2月25日，星期天标准品标准配的制备标准品介质系统应与待测样品一致或近似如，待测为血清样本，最好用零值血清制备标准品若用缓冲液制备标准品，应加入一定量的蛋白质（1-2%的BSA）或明胶第26页,共48页，2024年2月25日，星期天反应条件的选择第27页,共48页，2024年2月25日，星期天反应条件的选择缓冲体系添加剂反应体积温育条件样品处理第28页,共48页，2024年2月25日，星期天缓冲体系特异性结合反应的亲和常数受反应介质的pH和离子强度的影响第29页,共48页，2024年2月25日，星期天缓冲体系常见的缓冲体系磷酸盐缓冲液（PBS）巴比妥缓冲液乙酸盐缓冲液硼酸盐缓冲液Tris-HCl缓冲液第30页,共48页，2024年2月25日，星期天添加剂目的：改善试剂的稳定性/特殊需要要求：对特异性结合无影响常见添加剂EDTA-Na2ANSBSA/明胶抑肽酶叠氮钠/硫柳汞第31页,共48页，2024年2月25日，星期天反应体积抗原抗体反应∝反应物浓度减小反应体积，利于提高反应浓度，提高实验灵敏度体积过小，易出现加样误差，形成放射性复合物的量亦减少，测量误差增加常规选用反应体积为：0.3ml-1.2ml第32页,共48页，2024年2月25日，星期天温育条件反应的平衡常数与温度相关严格控制反应温度，包括整个分析至离心过程测定指标不同，其对温度的依赖程度亦不同温度与反应速度相关提高反应温度，可加速反应，但亲和力下降4℃抗体亲和力最大，但反应时间较长目前多采用较短时间37℃或室温孵育第33页,共48页，2024年2月25日，星期天样品处理

样品中可能存在各种干扰物质，或影响特异性反应的物质。故许多分析系统需要对分析样品进行预处理，常用的预处理方法是稀释或提取。第34页,共48页，2024年2月25日，星期天反应方式的选择第35页,共48页，2024年2月25日，星期天反应方式平衡法顺序饱和法即时法第36页,共48页，2024年2月25日，星期天反应方式平衡法AbAgAg*加入分离剂Ag*AbAg*方法学评价

稳定、重复性好、剂量反应曲线具有竞争性分析的典型特征，灵敏度相对较低

第37页,共48页，2024年2月25日，星期天反应方式顺序饱和法(非平衡竞争体系)AbAg平衡Ag*AbAg*AgAg*Ab终止反应方法学评价

灵敏度较高，但因第二次孵育时间较短，要求标记抗原的比活性较高，并且要求分离方法更为精细。

因存在两次温育，曲线偏离典型特征，且反应稳定性较差。

第38页,共48页，2024年2月25日，星期天反应方式即时法

在反应尚未达完全平衡时终止反应，并进行分离测定。

要求：需严格控制反应时间。

第39页,共48页，2024年2月25日，星期天分离方法的选择第40页,共48页，2024年2月25日，星期天分离系统

分离系统应依据实验要求选择。其对放射免疫分析的结果影响较大，分离不全或错分都可造成剂量反应曲线异常。

不同分离方法NSB差异较大，亦可影响反应的灵敏度，因此，选择适宜的分离系统更是建立放射免疫系统的重要步骤之一。第41页,共48页，2024年2月25日，星期天分离系统常用的分离体系125I3H双抗体-PEG/固相分离法活性炭吸附法第42页,共48页，2024年2月25日，星期天方法学鉴定第43页,共48页，2024年2月25日，星期天方法学鉴定剂量反应曲线稳定性检查灵敏度检查精密度检查健全性检查正常参考范围确定临床有效性检查第44页,共48页，2024年2月25日，星期天方法学鉴定剂量反应曲线稳定性检查NSB/TB0/T截距/斜率EDPDP图第45页,共48页，2024年2月25日，星期天方法学鉴定剂量反应曲线稳定性检查灵敏度检查精密度检查健全性检查正常参考范围确定临床有效性检查第46页,共48页，2024年2月25日，星期天QCXSD12345678910L3.310.253.203.523.563.113.282.503.03.403.523.0M10.51.2511.710.611.511.110.39.6010.69.807.908.70H30.