质粒提取鉴定

质粒提取鉴定

质粒含有某些染色体所没有的基因，编码某些功能蛋白质（表达某种遗传性状，如抗药性（抗氨卞青霉素、抗四环素等），耐受重金属，产生细菌素等等）。即很多质粒往往都赋予其宿主细胞一定的表型。

第2页,共32页，2024年2月25日，星期天质粒DNA提取、鉴定

暨大医学院生化系蒋建伟第3页,共32页，2024年2月25日，星期天质粒分类：

严紧型（每个细胞1－5个质粒）质粒的复制与宿主染色体复制同步进行，因而一个宿主细胞中只有一个或几个质粒拷贝。当宿主蛋白合成被抑制，染色体复制停止，质粒的复制也停止；松弛型（每个细胞10－200个质粒）质粒的复制受“松弛型控制”。当宿主蛋白质合成受抑制（如加入氯霉素），染色体复制停止时，质粒仍可大量复制。此时，一个宿主细胞中质粒数目可多至数千个拷贝。第4页,共32页，2024年2月25日，星期天具备基因工程质粒载体的条件：①多克隆位点（multiplecloningsite,MCS),一段短的序列上有多种限制性内切酶切口，每种只有一个切口。②选择性标记，如抗药性。③本身分子量不宜过大，有一定容量。④有一定的copynumber——每个宿主菌可能容纳的最多质粒数。第5页,共32页，2024年2月25日，星期天

pBR322质粒(4.36kp),最早应用于基因工程的载体，现在仍在广泛应用。•序列已全部清楚•数十个内切酶位点•2个抗药基因第6页,共32页，2024年2月25日，星期天

pBR322质粒(4363bp):

主要包括：①限制性内切酶位点（插入外源基因）；②含有terr、ampr抗药基因，可作为筛选标志。③含有复制起始点ori（赋予其复制特性）。第7页,共32页，2024年2月25日，星期天第8页,共32页，2024年2月25日，星期天pUC18/19pUC载体系列是由大肠杆菌pBR322质粒与Ｍ13噬菌体改建而成的双链DNA质粒载体。质粒含有LacZ的N端146个AA残基的编码基因，编码产物为β半乳糖苷酶的α片段。

Lac－E.coli（突变型宿主细胞）：可表达该酶的ω片段.单独存在的α或ω片段均无活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段，宿主细胞才有β半乳糖苷酶活性，使特异底物产生蓝色化合物（α-互补)。第9页,共32页，2024年2月25日，星期天

α互补的检测α片段ω片段α片段ω片段第10页,共32页，2024年2月25日，星期天本次实验用pEC-CTpEC-CT在pcDNA3基础上构建pEC-ct质粒：8.0kb

有HindⅢ,BamHⅠ酶切点，可切出CD基因（1.2kb）第11页,共32页，2024年2月25日，星期天质粒DNA提取和纯化步骤：培养细菌收集和裂解细菌纯化质粒DNA第12页,共32页，2024年2月25日，星期天接种：从-20℃取出菌种，斜面划线接种，37℃培养24h单克隆培养：挑单个菌落，接种于LB培养液中（含Amp50μg/ml)4-6h。菌液0.2ml＋10mlLB培养基（含Amp50μg/ml)37℃培养过夜。细菌的培养

第13页,共32页，2024年2月25日，星期天3.扩大培养：培养液3ml,接种于60mL的LB培养液（含Amp50μg/ml),振摇200rpm，37℃(4-6h),使A580＝0.4-0.6。4.加氯霉素：加氯霉素，终浓度40μg/ml，继续培养15-17h.第14页,共32页，2024年2月25日，星期天本次实验包括：1.菌体收集2.菌体裂解、质粒DNA提取、纯化3.鉴定2人一组第15页,共32页，2024年2月25日，星期天1.取8个1.5mlEppendorf管，分别加入细菌培养液1.4ml↓9000rpm2-3min

↓↘弃上清2.600μlSTE液依次溶解各管沉淀，合并一管再用200μlSTE液清洗各管，清洗液合并一管（收集菌体）↓

9000rpm2-3min,弃上清（保留菌体）收集菌体600ul第16页,共32页，2024年2月25日，星期天3.沉淀悬于200ul溶液I，枪头吹打混匀

↓放置3min

4.加入400ul溶液II，颠倒EP管20～30次（动作轻!！）

II：0.2NNaOH-1%SDS↓放置5min5.加入300ul溶液III，充分混匀（温和操作）↓

10min

沉淀蛋白质和染色体DNAIII：3M醋酸钾/2M醋酸。裂解碱裂解法提取质粒DNAI：50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0；RNase第17页,共32页，2024年2月25日，星期天溶液I成分：50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0；Tris-Cl溶液：控制溶液的pH，50mM葡萄糖：使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。EDTA：是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长第18页,共32页，2024年2月25日，星期天溶液II成份：0.2NNaOH/1%SDS；

NaOH：溶解细胞。之所以叫碱裂解法，因NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，都会在瞬间溶解，细胞从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的变化。

SDS：破坏膜系统。第19页,共32页，2024年2月25日，星期天加溶液II要记住两点：

1.时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；2.操作必须温柔，不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会混入质粒DNA中，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。

第20页,共32页，2024年2月25日，星期天溶液III成份：

3M醋酸钾/2M醋酸

等电点沉淀。

中和NaOH，长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和。第21页,共32页，2024年2月25日，星期天12000rpm3min

↓↘弃沉淀

6.将上清转移至另一Eppendorf管中，加0.6倍体积异丙醇(540ul

)，颠倒混匀↓室温5min

离心12000rpm10min↓↘弃上清沉淀干燥，室温10min↓7.加TE500ul溶解沉淀同时倒胶1%,330ml/小班沉淀质粒第22页,共32页，2024年2月25日，星期天SDS-醋酸钾沉淀的形成不能将所有的蛋白质沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。第23页,共32页，2024年2月25日，星期天8.加入等体积饱和酚，振摇1min，充分混匀↓12000rpm5min9.将上层水相转移至另一Eppendorf管中，用等体积氯仿-异戊醇抽提，振摇1min，充分混匀↓12000rpm5min10.将上层水相转移至另一Eppendorf管中，加入预冷的2.5倍体积无水乙醇↓-20℃30min纯化质粒易错第24页,共32页，2024年2月25日，星期天酚/氯仿/异丙醇酚：蛋白质的变性作用远大于氯仿，可最大程度将蛋白质抽提掉，但是在高浓度的盐溶液中，离心后酚会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；我们单独用酚抽提酚，会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除。至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。第25页,共32页，2024年2月25日，星期天

离心12000rpm10min↓↘弃上清沉淀干燥↓11.加入TE25-30ul,溶解沉淀（反复吹打至完全溶解）

EP管上做记号第26页,共32页，2024年2月25日，星期天质粒的分离、纯化半定量检测浓度酶切电泳鉴定第27页,共32页，2024年2月25日，星期天鉴定质粒提取质粒、单酶切、双酶切样本一起电泳，与marker比较，估计质粒大小。线性化（单酶切）：

用HindⅢ将质粒酶切、电泳，估计其分子大小。双酶切：

用HindⅢ和BamHⅠ将质粒pEC-CT所含的CD基因1.2kb片段切出。第28页,共32页，2024年2月25日，星期天鉴定

(质粒分子量、纯度及是否含有所需要DNA段)(一)酶解双酶切体系：单酶切体系：sample

5ul

sample

5ulBamHⅠ1ulHindⅢ1ulHindⅢ1ul10×buffer2.5ul10×buffer2.5ul

ddH2O

15ulddH2O

15ul混匀，离心(瞬时)，37℃２ｈ第29页,共32页，2024年2月25日，星期天13.DNA浓度测定

溴乙锭荧光法(半定量法，