《单细胞测序样本采集与处理规范GBT+43776-2024》详细解读

《单细胞测序样本采集与处理规范GB/T43776-2024》详细解读contents目录1范围2规范性引用文件3术语和定义4缩略语5总体原则和要求6样本采集contents目录6.1采集前的准备7样本处理7.1处理前的准备7.2处理8质量验证附录A(资料性)组织细胞酶解法附录B(资料性)细胞群富集方法contents目录鲋录C(资料性)台盼蓝染色操作流程C.1仪器C.2试剂耗材C.3检测步骤参考文献011范围01021.1适用对象适用于各类生物样本，包括但不限于人体细胞、动植物细胞、微生物等。本规范适用于单细胞测序样本的采集、处理、保存和运输等环节。医学领域用于疾病诊断、治疗监测、药物研发等。生物学领域用于基因表达调控、细胞分化、物种进化等研究。农业领域用于动植物品种改良、病虫害防治等。1.2应用领域样本采集和处理过程中应遵循伦理和隐私保护原则。样本应来自合法来源，并符合相关法律法规要求。采集和处理过程中应保证样本的完整性和代表性，避免污染和损伤。1.3限制条件022规范性引用文件基因组DNA提取和纯化方法常用的基因组DNA提取方法包括酚氯仿抽提法、高盐沉淀法、硅胶柱吸附法等，这些方法的选择应根据样本类型、实验条件和实验需求进行。DNA纯化方法包括乙醇沉淀、离心柱纯化等，用于去除提取过程中可能产生的杂质和抑制剂，提高DNA的质量和纯度。单细胞分离方法包括显微操作、流式细胞术、微流控技术等，这些方法可以实现单个细胞的精确分离和捕获。细胞裂解技术包括化学裂解、酶裂解、物理裂解等，用于破坏细胞膜和核膜，释放细胞内的遗传物质。单细胞分离与裂解技术包括DNA片段化、末端修复、加A尾、连接测序接头等步骤，用于构建适用于高通量测序的文库。测序文库构建包括文库浓度、片段大小分布、测序接头连接效率等指标的检测，用于确保文库的质量和测序效果。质检标准测序文库构建与质检标准包括原始数据质控、序列比对、变异检测等步骤，用于将测序数据转化为可用于生物学研究的信息。包括基因表达量分析、基因功能注释、细胞亚群鉴定等，用于挖掘单细胞测序数据中的生物学意义和潜在应用价值。数据处理与分析流程数据分析方法数据处理流程033术语和定义单细胞测序是一种高通量测序技术，通过对单个细胞进行基因组、转录组或表观组测序，揭示单个细胞的基因表达、变异和调控等信息。单细胞测序技术基于微流控、微滴或微孔等单细胞分离方法，结合高通量测序平台，实现对单个细胞的高深度测序。定义技术原理3.1单细胞测序定义样本采集是指从生物体中获取用于单细胞测序的单细胞或细胞团的过程，包括组织取样、细胞分离和单细胞捕获等步骤。采集原则样本采集应遵循无菌、无酶、低损伤和低应激等原则，以确保获取的单细胞具有代表性和活性。3.2样本采集3.3样本处理定义样本处理是指对采集的单细胞或细胞团进行预处理、扩增和建库等步骤，以制备用于高通量测序的文库。处理流程样本处理流程包括细胞裂解、DNA/RNA提取、逆转录、扩增和纯化等步骤，其中每个步骤都需要严格的操作规范和质量控制。定义质量控制是指在单细胞测序样本采集、处理和分析过程中，对实验条件、试剂、仪器和操作流程等进行严格监控和管理，以确保实验结果的准确性和可靠性。质控指标质量控制指标包括细胞活性、捕获效率、文库质量、测序深度和覆盖度等，这些指标可以有效评估单细胞测序实验的质量和可靠性。3.4质量控制044缩略语01020304SCSSingleCellSequencing，单细胞测序WGAWholeGenomeAmplification，全基因组扩增QCQualityControl，质量控制NGSNextGenerationSequencing，下一代测序技术4.1常见缩略语SCS用于表示单细胞测序技术，是研究单个细胞基因组、转录组等的重要手段。WGA是单细胞测序前对单个细胞进行全基因组扩增的方法，以提高测序深度和覆盖率。QC在单细胞测序中用于表示质量控制，包括样本质量、测序数据质量等方面的评估和控制。NGS是下一代测序技术的缩写，是单细胞测序所依赖的核心技术之一。010203044.2缩略语在单细胞测序中的应用055总体原则和要求5.1标准化操作遵循单细胞测序样本采集、处理、储存和运输的标准化操作流程，确保样本质量和数据可靠性。使用经过验证和校准的仪器设备和试剂，避免操作过程中的污染和误差。建立严格的质量控制体系，对样本采集、处理、储存和运输等各环节进行监控和记录。定期进行质量评估和审计，确保实验室操作符合相关法规和标准要求。5.2质量控制实验室应建立完善的安全管理制度，包括生物安全、化学安全和辐射安全等方面。操作人员应接受相关安全培训，熟悉应急处理措施，确保实验室安全稳定运行。5.3安全管理建立完善的数据管理体系，确保实验数据的完整性、准确性和可追溯性。对实验数据进行定期备份和加密存储，防止数据丢失和泄露。同时，应建立数据共享和访问机制，促进数据交流和合作。5.4数据管理与可追溯性066样本采集确保采集人员具备相关专业知识和操作技能。根据实验需求，选择合适的采集器具和试剂。确认样本来源、种类和数量，制定详细的采集计划。6.1采集前准备无菌操作在整个采集过程中，需严格遵守无菌操作规程，避免污染。采集部位选择根据实验需求选择合适的采集部位，如血液、组织等。采集时间尽量在短时间内完成采集，以减少样本离体后的变化。6.2采集方法03运输如需将样本运输至其他地点进行处理，需选择合适的运输方式和条件，确保样本在运输过程中的稳定性和安全性。01样本标识对采集的样本进行唯一性标识，包括样本名称、来源、采集时间等信息。02暂时保存将采集后的样本放置在适宜的条件下暂时保存，等待进一步处理。6.3采集后处理尽量避免在同一部位进行多次采集，以减少对样本的损伤和污染风险。避免多次采集在采集过程中，需注意防止不同样本之间的交叉污染。防止交叉污染在采集人体样本时，需遵守相关伦理规范和法律法规，保护受试者的合法权益。遵守伦理规范6.4注意事项076.1采集前的准备确定采样对象根据需要选择合适的单细胞生物或组织进行采样。明确采样数量根据实验设计和分析需求，确定所需采集的单细胞数量。了解采样环境熟悉采样环境的温度、湿度、光照等条件，以便更好地保存样本。6.1.1明确采样目的和要求采样器具准备无菌的采样器具，如吸管、移液器、离心管等，确保采样过程中不受到污染。试剂准备根据实验需求，准备相应的试剂，如培养基、消化酶、裂解液等。储存容器选择适当的储存容器，如液氮罐、超低温冰箱等，用于保存采集的单细胞样本。6.1.2采样器具与试剂准备培训采样人员对采样人员进行专业培训，熟悉采样流程、器具使用、安全防护等知识。防护措施采样人员需穿戴防护服、手套、口罩等防护用品，确保采样过程的安全性。采样操作规范制定详细的采样操作规范，确保采样人员按照规范进行操作，避免误差和污染。6.1.3采样人员培训与防护确保采集环境符合无菌操作要求，避免污染。选择合适的采集器具，如针头、注射器等，确保无菌、无热源、无毒性。准备必要的采集辅助用品，如消毒液、棉签、采血管等。6.2.1采集前准备根据不同的样本类型选择合适的采集方法，如穿刺采集、切割采集等。遵循无菌操作原则，避免在采集过程中引入外源性污染。确保采集到足够的样本量，以满足后续实验需求。6.2.2采集方法03将处理后的样本妥善保存，并尽快送至实验室进行后续分析。01采集后应立即对样本进行初步处理，如分离、清洗、固定等。02对采集器具进行清洗、消毒处理，避免交叉感染。6.2.3采集后处理采集人员应具备相应的专业知识和技能，确保采集过程的安全性和准确性。遵循相关法律法规和伦理规范，确保样本采集的合法性和合规性。采集过程中应注意保护患者隐私，尊重患者权益。6.2.4注意事项087样本处理接收样本时应记录样本信息，包括样本类型、数量、采集时间等。检查样本容器是否完整、无破损，样本标识是否清晰。核实样本采集与处理是否符合规范要求。7.1样本接收与检查

7.2样本前处理根据实验需求进行样本前处理，如洗涤、离心、过滤等。处理过程中应避免样本污染和交叉污染。确保处理后的样本质量符合实验要求。123根据实验需求将样本分装至合适的容器中，确保分装量准确。分装后的样本应妥善保存，避免污染和变质。保存条件应符合实验要求，如温度、湿度、光照等。7.3样本分装与保存010203样本运输应符合生物安全要求，确保样本在运输过程中不被污染或损坏。运输过程中应记录样本状态和环境条件。建立样本追踪系统，确保样本来源可追溯。7.4样本运输与追踪097.1处理前的准备实验室应具备良好的通风和洁净度，确保空气流通且无污染。实验室应配备符合单细胞测序要求的仪器设备，如显微镜、离心机、冰箱等。实验室应定期进行消毒和清洁，保持环境整洁。7.1.1实验室环境与设施要求7.1.2实验器材与试剂准备准备所需的实验器材，如移液器、吸头、离心管、PCR管等，确保无菌且无DNA/RNA酶污染。准备所需的试剂，如细胞裂解液、DNA/RNA提取试剂、PCR扩增试剂等，确保试剂质量可靠。样本采集应遵循无菌操作原则，避免污染。采集的样本应尽快送至实验室进行处理，运输过程中应保持低温并避免剧烈震荡。样本应详细记录采集时间、部位、患者信息等，确保样本可追溯。7.1.3样本采集与运输要求实验人员应接受单细胞测序相关知识和技能培训，熟悉实验操作流程。实验人员应穿戴防护服、手套、口罩等防护用品，确保实验安全。7.1.4实验人员培训与防护107.2处理接收样本时，应检查样本容器是否完好、标签是否清晰、信息是否齐全等，并记录接收时间和人员。对于不符合要求的样本，应及时与送检单位或个人联系，并按照相关规定进行处理。实验室应建立样本接收和登记制度，确保样本信息的完整性和可追溯性。7.2.1样本接收与登记根据实验需求，对样本进行适当的前处理，如离心、洗涤、固定等。前处理过程中，应严格遵守实验室安全规范，避免交叉污染和样本损失。对于需要特殊处理的样本，应按照相关规定进行操作，并记录处理过程和结果。7.2.2样本前处理根据实验需求，选择合适的单细胞分离与捕获方法，如显微操作、流式细胞术、微流控技术等。在单细胞分离与捕获过程中，应确保细胞的活性和完整性，避免对细胞造成不必要的损伤。对于分离与捕获的单细胞，应及时进行后续实验或保存，避免细胞死亡或功能丧失。7.2.3单细胞分离与捕获01实验室应建立严格的质量控制体系，对处理过程中的关键步骤进行监控和记录。02对于处理过程中出现的问题或异常情况，应及时进行分析和处理，并记录处理过程和结果。03实验室应定期对处理流程和结果进行回顾和总结，不断优化和改进处理方法。7.2.4质量控制与记录118质量验证细胞活性确保采集的单细胞样本具有足够的活性，以进行后续的测序分析。细胞数量验证采集的细胞数量是否符合实验要求，以保证测序结果的准确性。DNA/RNA质量检测提取的DNA/RNA的完整性、纯度和浓度，确保其满足测序要求。8.1质量控制指标03分子生物学方法采用PCR、qPCR、凝胶电泳等分子生物学方法，检测DNA/RNA的质量和数量。01显微镜观察通过显微镜观察细胞的形态、大小和活性，以初步判断样本质量。02流式细胞仪检测利用流式细胞仪对细胞进行多参数分析，包括细胞大小、颗粒度、荧光强度等，以进一步评估样本质量。8.2质量验证方法重新采集如样本质量不合格，应重新采集样本，确保后续实验的顺利进行。样本保存与记录对不合格样本进行妥善保存，并记录相关信息，以便后续分析和处理。原因分析与改进分析导致样本不合格的原因，并采取相应的改进措施，以避免类似问题的再次发生。8.3不合格样本处理12附录A(资料性)组织细胞酶解法利用酶的特异性酶解法利用特定的酶对细胞间质进行降解，从而释放单个细胞。这种方法能够保持细胞的完整性和活性，为后续的单细胞测序提供高质量的样本。温和条件酶解法在温和的条件下进行，避免了对细胞的机械损伤和化学刺激，有利于保持细胞的原始状态。酶解法的原理胶原酶适用于降解细胞间质中的胶原蛋白，常用于分离纤维组织和上皮组织等。透明质酸酶用于降解透明质酸，有助于分离富含透明质酸的细胞间质。蛋白酶可降解多种蛋白质成分，适用于多种组织类型的细胞分离。酶种类的选择取适量新鲜组织样本，去除血液、脂肪等非目标成分，剪碎成小块。组织样本准备根据所选酶的种类和浓度，配制适量的酶溶液。酶溶液配制将剪碎的组织与酶溶液混合，置于恒温振荡器中消化一定时间，使细胞间质充分降解。组织消化消化后的组织通过过滤网过滤去除未消化的组织块，收集滤液中的单个细胞。用无菌生理盐水清洗细胞数次，去除残留的酶和细胞碎片。细胞过滤与清洗酶解法的步骤010204注意事项酶解法需要在无菌条件下进行，以避免细胞污染。消化时间不宜过长，以免对细胞造成损伤。过滤网的孔径大小应适中，以保证单个细胞的通过率并去除未消化的组织块。清洗过程中应避免用力吹打细胞，以免对细胞造成机械损伤。0313附录B(资料性)细胞群富集方法激光捕获显微切割技术通过激光束在显微镜下的精确定位，将目标细胞从周围组织中切割并富集。磁珠分选技术利用磁珠与特定细胞表面标志物的结合，通过磁场作用实现目标细胞的分离和富集。微流控技术利用微流控芯片或微流控系统，实现对单细胞或少量细胞的精确操控和富集。常用的单细胞富集技术根据待研究细胞的大小、形状、表面标志物等特征，选择适合的富集方法。细胞类型考虑样本的来源、数量和质量，选择能够高效富集目标细胞的方法。样本来源根据实验目的和后续分析需求，选择能够最大程度保留细胞信息和活性的富集方法。实验目的富集方法的选择原则富集方法的操作步骤样本处理对样本进行适当的处理，如消化、离心、洗涤等，以获取单细胞悬液。富集操作根据所选的富集方法，进行相应的操作，如磁珠分选中的磁珠孵育、洗涤和磁分离等。富集效果评估对富集后的细胞进行计数、活性检测等，以评估富集效果。操作规范严格按照所选富集方法的操作规范进行实验，避免操作失误导致实验失败。试剂质量使用高质量的试剂和耗材，以保证实验结果的准确性和可靠性。样本保存对富集后的细胞进行适当的保存和处理，以备后续实验使用。富集方法的注意事项14鲋录C(资料性)台盼蓝染色操作流程试剂准备台盼蓝染液、PBS缓冲液、细胞悬液等。器材准备显微镜、离心管、移液器、细胞计数板等。实验环境准备确保实验室内清洁、无菌，操作台面消毒。实验前准备细胞悬液制备染色处理洗涤与离心显微镜观察台盼蓝染色步骤将待测细胞用PBS缓冲液洗涤并离心，去除上清液，加入适量PBS缓冲液重悬细胞。染色后，加入适量PBS缓冲液洗涤细胞，离心去除上清液。取少量细胞悬液与台盼蓝染液按一定比例混合，染色时间一般为2-3分钟。取少量染色后的细胞悬液滴于细胞计数板上，在显微镜下观察并计数活细胞和死细胞数量。台盼蓝染液具有毒性，操作时需佩戴手套和口罩等防护用品。细胞悬液制备过程中需保持细胞活性，避免过度操作导致细胞损伤。染色时间不宜过长，否则会影响细胞活性判断。显微镜观察时需保持细胞计数板清洁，避免杂质干扰计数结果。注意事项15C.1仪器单细胞捕获仪器用于从复杂的生物样本中捕获单个细胞，确保后续测序的准确性和可靠性。显微操作仪器用于在显微镜下对单细胞进行精确操作，如细胞挑选、移动和定位等。试剂处理仪器用于处理与单细胞测序相关的试剂，确保试剂的纯度和稳定性。C.1.1仪器种类高精度仪器应具备高精度，以确保对单细胞的精确操作和测量。高稳定性仪器应具备高稳定性，以确保长时间运行时的准确性和可靠性。易操作性仪器应具备易操作性，以方便实验人员进行操作和调整。C.1.2仪器性能要求为确保仪器的准确性和可靠性，应定期对仪器进行校准。定期校准仪器应定期进行维护保养，以延长使用寿命和保持性能稳定。维护保养当仪器出现故障时，应及时进行处理和修复，以避免影响实验进度和结果。故障处理C.1.3仪器校准与维护16C.2试剂耗材

C.2.1试剂选择细胞裂解液应选择能有效裂解单细胞且不影响后续测序步骤的试剂，避免使用含有酶抑制剂或会影响核酸完整性的裂解液。酶和缓冲液用于单细胞全基因组扩增的酶应具有高保真性和高扩增效率，缓冲液成分需与酶相匹配，保证扩增反应的顺利进行。洗涤液和封闭液用于洗涤和封闭微孔板或芯片的试剂应能有效去除杂质并防止非特异性结合，以保证单细胞捕获和测序的准确性。123应选择适用于单细胞捕获和测序的微孔板或芯片，其表面应经过特殊处理以减少非特异性结合和背景噪音。微孔板或芯片用于操作试剂和单细胞的移液器应具有高精度和高稳定性，吸头应选用无DNA/RNA酶污染的一次性产品。移液器和吸头用于储存和处理样本的离心管和试管应选用无DNA/RNA酶污染的材质，并经过严格灭菌处理。离心管和试管C.2.2耗材准备试剂耗材应符合国家相关标准和规范，具有相应的生产许可证和经营许可证。试剂耗材的储存和运输应符合相关规定，避免受潮、受热、受光等影响而导致质量变化。试剂耗材应在使用前进行质量检查，包括外观、包装、标签、有效期等方面的检查，确保其符合使用要求。试剂耗材的使用过程中应注意安全防护措施，避免交叉污染和生物安全风险。C.2.3试剂耗材质量