课题血红蛋白的提取和分离

课题血红蛋白的提取和分离第2页,共37页，2024年2月25日，星期天1、分离生物大分子的基本思路选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子2、蛋白质分离和提取的原理根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质相关链接第3页,共37页，2024年2月25日，星期天3、高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种特性，作用结果是什么被破坏？变性、变性，空间结构4、人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富（红色）便于提取血红蛋白第4页,共37页，2024年2月25日，星期天一.基础知识

（一）

凝胶色谱法：（也叫分配色谱法）根据被分离物质的相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用来分离蛋白质的有效方法.1、概念：2、凝胶色谱法的原理—分子筛效应①大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。②当不同的蛋白质通过凝胶时，分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较。③分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。3、依据的特性：相对分子质量的大小4、具体过程第5页,共37页，2024年2月25日，星期天洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，

促使蛋白质分子的差速流动。混合物上柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子

第6页,共37页，2024年2月25日，星期天（二）缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变1、作用2、缓冲溶液的配制通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液阅读：在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)第7页,共37页，2024年2月25日，星期天（三）电泳：1、概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程2、原理:①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离3、常见方法:琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳4、实例①应用十二烷基磺酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量第8页,共37页，2024年2月25日，星期天蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素②原理③

SDS作用为了消除净电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入SDS,SDS能与各种蛋白质形成复合物。SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小第9页,共37页，2024年2月25日，星期天二、实验操作样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定1、样品处理：（一）蛋白质提取和分离步骤:(四步）血液组成（二）操作过程①成分血液血浆水分固体物质血浆蛋白无机盐磷脂葡萄糖血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）两个a－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团第10页,共37页，2024年2月25日，星期天每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色②组成及作用本课题可选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的血液来分离血红蛋白③选材(1)红细胞的洗涤①洗涤红细胞目的除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少②洗涤操作A、采集血样B、低速短时间离心（为什么）速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果第11页,共37页，2024年2月25日，星期天C、吸取血浆：上层透明的黄色血浆D、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤E、低速离心（低速短时间）F、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净(2)血红蛋白的释放加蒸馏水（使红细胞大量吸水胀裂）到原血液体积，再加40％体积的甲苯（溶解红细胞的细胞膜），置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白(3)分离血红蛋白溶液①过程将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min第12页,共37页，2024年2月25日，星期天第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）②试管中溶液层次第13页,共37页，2024年2月25日，星期天用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体③分离第14页,共37页，2024年2月25日，星期天取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时2、粗分离除去样品中分子量较小的杂质或用于更换样品中的缓冲液①过程②透析目的（透析）第15页,共37页，2024年2月25日，星期天第16页,共37页，2024年2月25日，星期天1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是（）A弄清各种蛋白质的空间结构B弄清各种蛋白质的功能C弄清各种蛋白质的合成过程D获得高纯度的蛋白质D2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是()A相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D二者根本无法比较A

教学反馈第17页,共37页，2024年2月25日，星期天3．凝胶色谱法是根据（）分离蛋白质的有效方法。

A分子的大小B相对分子质量的大小

C带电荷的多少D溶解度4．缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来持（）基本不变。

A温维度BpHC渗透压D氧气浓度5．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（）的电极移动。

A相同B相反C相对D相向6.哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（）与氧气的运输有关。

A血红蛋白B肌红蛋白C肌动蛋白D肌球蛋白BBBA第18页,共37页，2024年2月25日，星期天7．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（）的含量最多。

A白细胞B血小板C红细胞D淋巴细胞8．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（）。

A.NaClB.甲苯C.蒸馏水D.柠檬酸钠．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第3层是（）

A无色透明的甲苯层B脂溶性物质的沉淀层

C血红蛋白的水溶液D其他杂质的暗红色沉淀物CDC第19页,共37页，2024年2月25日，星期天第20页,共37页，2024年2月25日，星期天3、纯化（凝胶色谱操作）（1）凝胶色谱柱的制作①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平②底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端第21页,共37页，2024年2月25日，星期天底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底注意事项：③顶塞的制作打孔安装玻璃管④组装将上述三者按相应位置组装成一个整体第22页,共37页，2024年2月25日，星期天第23页,共37页，2024年2月25日，星期天（2）凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择A、材料“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克B、代表意义：交联葡聚糖凝胶（G-75）第24页,共37页，2024年2月25日，星期天配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液②凝胶的前处理③凝胶色谱柱的装填方法A、固定B、装填将色谱柱处置固定在支架上将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀第25页,共37页，2024年2月25日，星期天注意：2、装填凝胶柱时不得气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙思考:你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？第26页,共37页，2024年2月25日，星期天第27页,共37页，2024年2月25日，星期天1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果在装填过程中要注意些什么问题呢？2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时④洗涤平衡第28页,共37页，2024年2月25日，星期天（3）样品加入与洗脱①调节缓冲液面②滴加透析样品吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐关闭出口第29页,共37页，2024年2月25日，星期天第30页,共37页，2024年2月25日，星期天③样品渗入凝胶床④洗脱加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口小心加入pH为7的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml一试管，连续收集（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）第31页,共37页，2024年2月25日，星期天讨论：答：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能⑥注意：正确的加样操作1、不要触及破坏凝胶面2、贴壁加样3、使吸管管口沿管壁环绕移动1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？第32页,共37页，2024年2月25日，星期天2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。第33页,共37页，2024年2月25日，星期天血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的