磁变性淀粉微球固定化酶技术

磁变性淀粉微球固定化酶技术1所谓酶的固定化是指利用化学或物理手段将游离的酶定位于限定的空间区域并使其保持活性和可反复使用的一种基本技术。在理论及实际应用上，酶固定化技术克服了游离酶的许多缺点，但是固定化酶技术目前还存在固定效率低、载体的有毒性、成本高、稳定性差、不能大规模生产等问题，这些都限制了固定化酶技术的发展与应用。在固定化酶技术中，载体材料的结构和性能对酶的活性保持及应用至关重要，因此对固定化酶载体的研究成为该领域研究的热点。磁性微球固定化酶就是利用磁性微体作为载体进行酶的固定化，由于其具有环保、酶重复利用效果好和降低生产成本等优点，近几年已经成为研究的焦点。2磁性淀粉微球是一类性能优良的磁变性淀粉，它以淀粉类物质为载体，包埋金属或金属氧化物，或者在磁流体上共价吸附或聚合淀粉类物质形成的具有磁性的功能高分子材料，一般由磁核和淀粉分子层构成。目前在固定化酶中使用磁核以Fe3O4最为常见。当磁性粒子晶体直径小于30nm时，则具有超顺磁性。磁性淀粉微球的直径一般在微米级或纳米级，因此其具有超顺磁性，在外加磁场的作用下快速分离，容易被磁力控制、定向、定位移动和测定，此外，还具有表面效应、体积效应、量子尺寸效应和功能基特性等纳米材料微粒子的特性，通过磁性淀粉微球表面的高分子壳层，可在其表面可引入一些功能基团(如-OH，-COOH，-NH2等)，通过这些基团可将酶修饰于磁性微粒表面。3作为一种新的固定化酶载体材料，用磁性变性淀粉微球作为固定化酶的载体具有无毒、材料来源广、制备方便、成本较低、操作简便、可生物降解、从反应体系中易分离和回收、利用外部磁场可以控制磁变性淀粉材料同定化酶的运动方式和方向，替代传统的机械搅拌方式，提高固定化酶的催化效率等诸多优点，而且还具有良好的生物相容性，因此其在固定化酶领域展现了广泛的应用前景。41.磁变性淀粉微球的制备根据不同的应用方式，磁变性淀粉微球有三种结构形式，即由金属或金属氧化物组成核，淀粉分子材料组成壳层；或者将淀粉材料作为核，磁性材料作为壳层；除此之外，也可以做成夹心结构，即外层、内层为淀粉分子材料，中间层为磁性材料。其中第一种研究得最多。高分子磁性微球的制备方法有很多，目前核壳式结构的磁性微球的制备方法主要有包埋法、单体聚合法、共沉淀法、原位法等。51.1包埋法：包埋法是运用机械搅拌、超声分散等方法使磁性粒子均匀分散于淀粉溶液中，通过雾化、絮凝、沉淀、蒸发等手段使淀粉材料包埋磁性粒子。磁性粒子表面与亲水性淀粉分子之间存在一定的亲和力，所以若把磁性粒子浸泡于这些亲水分子的溶液中，再经过乳化等处理过程，就可以在磁性粒子表面形成淀粉分子壳层。为了增加微球的稳定性，可用交联剂交联高分子壳层等进行稳定化处理。利用包埋法制备的磁性微球，方法简单，但得到的粒子粒径分布宽，微球形貌不易控制。另外，微球中常含有乳化剂、沉淀剂等杂质，因而在免疫诊断等领域会受到很大的限制。同时由于磁性材料一般为亲水性颗粒，所以包埋的高分子一般也要为亲水性分子，否则很难将磁性微粒完全包裹。这在一定程度上进一步限制了包埋法的应用。61.2体聚合法：单体聚合法是在磁性粒子和单体存在下，加入引发剂、稳定剂等进行聚合反应，得到内部包有磁性微粒的高分子微球，主要有悬浮聚合、分散聚合、乳液聚合、辐射聚合等单体聚合方法。单体聚合法的优点在于可以确保单体的聚合反应在磁性粒子表面顺利进行。由于磁性粒子是亲水性的，所以亲水性单体(如淀粉)容易在磁性粒子表面进行聚合，而对于亲油性单体(如苯乙烯等)聚合反应难以在磁性微粒表面进行，因此要对磁性微粒进行预处理或适当改变有机体的组成。单体聚合法制备的磁性微球粒径较大，且固载量小。目前研究较多的是乳液聚合法和分散聚合法。Noguchi等用乳液聚合法制备了磁性高分子微球。邱广明等报道了磁性聚苯乙烯微球的合成，得到了稳定性好、单分散的磁性微球。71.3共沉淀法：共沉淀法是金属离子在碱性条件下与高分子共沉淀，一步反应生成磁性高分子微球的方法：2Fe3++Fe2++8OH-→Fe3O4+4H2O。共沉淀法制备方法简单，制得的磁性微球粒径小，比表面积大，但只适用于表面含有特定功能基团的聚合物，且由于磁性无机粒子在聚合物微球的表面发生沉积，所以最终制备出变性淀粉或多糖复合微球的表面不光滑，大小不均匀，磁响应性较差，同时也限制了磁性复合微球的应用。81.4原位合成法：原位合成法是淀粉分子材料分子链上具有极性基团OH、-COOH等，在无氧条件下吸附二价铁离子(Fe2+)，然后滴入双氧水可把二价铁离子(Fe2+)氧化成Fe2O3或Fe3O4磁性粒子，从而制备得变性淀粉磁性微球。原位法合成的淀粉磁性微球的粒径和粒径分布取决于聚合物微球本身，因此磁性淀粉或多糖微球具有良好的单分散性，各微球的磁含量相同，在磁场下具有一致的磁响应性。VVeiga等利用原位聚合法制得超顺磁环氧氯丙烷交联淀粉粒子，并对其Fe含量、磁力及颗粒形貌进行了表征；Ugelstand等用原位法制备出了磁变性淀粉微球，并开发了系列商品化的产品Dynabeads。该产品已成功应用于微生物学、分子生物学、免疫学等诸多领域。92.磁变性淀粉微球固定化酶传统的固定化酶的载体有硅、活性炭、多孔玻璃球、硅藻土和离子交换树脂等，但由于这些载体反应界面小、传质阻力大等因素，固定化酶的应用效果受到一定限制。变性淀粉磁性微球作为酶的载体在功能基特性、表面效应和体积效应、机械刚性和稳定性、重复使用性、磁响应性等方面都具有很多优点。磁性微球固定化酶是将游离酶的催化活动完全或基本上限制在一定空间范围内的过程，基本原理为：将该磁性微球直接放入含有一定量酶的混合溶液中，使酶与微球表面活性基团充分交联。固定化反应结束后，利用外部磁场对其进行分离，然后再进行纯化，其方法可分为吸附法、交联法、共价偶合法、埋法等。102.1吸附法：通过氢键、电子亲和力等把酶固定在变性淀粉磁性微球表面的方法称为物理吸附法。该法条件温和，酶的构象变化较小或基本不变，因此对酶的催化活性影响小。但酶以离子键、氢键、偶极键及疏水健吸附在载体上，和载体之间结合力弱，在不适pH、高盐浓度、高温等条件下，酶易从载体脱落并污染催化反应产物等。112.2交联法：交联法是用双官能团试剂或多官能团试剂与游离酶的氨基酸残基交联，使酶分子和官能团之间形成共价键，制得三向的交联网状结构。除了酶分子之间发生交联外，还存在一定的分子内交联。常用的交联剂有戊二醛、双重氮联苯胺-2，2-二磺酸和环氧氯丙烷等。其中应用最广泛的是戊二醛，戊二醛分子内的醛基可与酶蛋白的游离氨基反应，形成席夫碱而使酶分子交联。用交联法制备的固定化酶结合牢固，可长时间使用。但是交联反应较激烈，酶活可能损失较大。实际上交联法往往与其他固定化方法联合使用作为其它固定化方法的辅助手段，这种采用两种或多种方法进行固定化的技术，称为双重或多重固定化法，用此法制备的固定化酶活性高，机械强度好。122.3共价偶合法：共价结合法是利用酶蛋白分子上的非必需基团与载体反应，形成共价结合的固定化酶的方法称为共价结合法。这时酶与载体结合非常牢固，不易发生酶的脱落，有良好的稳定性和可重复使用性，有利于保持酶的活性．而且磁响应性也较强，但载体的活化操作比较复杂。2.4包埋法：包埋法是酶在载体中发生聚合、沉淀，并被物理包埋于高聚物网格内的方法，一般反应条件温和，对酶自身的结构改变很少，因此酶活性损失较小，固定化效率较高。得到的磁性固定化酶很容易从反应混合物中回收，并且没有酶的活性损失。133.各种磁性微球固定化酶的应用由于磁性微球具有高分子微粒子的特性，可以对其表面进行化学修饰从而赋予其表面多种具有与生物活性物质反应的特殊功能基团，酶分子可通过物理吸附、交联、共价偶合等方式固定在磁性淀粉微球表面。磁性微球固定化酶有以下优点：(1)有利于固定化酶的分离和回收，操作简单、易行；(2)对于双酶反应体系，当一种酶的失活较快时，用磁性材料来固载另一种酶，回收

后可反复使用，降低成本；(3)利用外部磁场控制固定化酶的运动方式和方向，提高酶的催化效率；(4)改善酶的生物相容性、免疫活性、亲疏水性、提高酶的稳定性。143.1磁性微球固定化酶在化工生产上的应用：磁性微球固定化酶可催化多种化学反应，在化工过程中具有显著的优点，可以提高对应选择性及重复利用率。例如，Bai等以超顺磁性颗粒Fe3O4作为载体，经碳二亚胺活化共价结合脂肪酶CRL，并研究此固定化脂肪酶催化酯化拆分外消旋薄荷醇的反应，实验证实固定化脂肪酶具有较高的对映选择性和良好的重复利用性。并且在皮革的生产过程中采用磁性固定化酶技术，在酶处理达到预期目的之后，可以将其中的酶完全回收，这样不仅提高了经济效益，而且有利于皮革产品质量的控制。153.2磁性微球固定化酶在食品工业上的应用由于固定化酶具有较好的稳定性，磁性微球固定化酶技术在食品、发酵工业、淀粉糖工业和乳制品工业方面具有好的应用前景。例如，Qiu等采用粒径为0.08-0.8μm的Fe3O4/P(St-MA)微球为载体，用共价偶联法固定α-淀粉酶，并用其催化淀粉转化为葡萄糖，研究结果表明，固定化淀粉酶的总活力达113800U，最高固载量为44.3mg/g，活性回收率为47.2%，与游离酶相比该固定化酶具有较高的稳定性。3.3磁性微球固定化酶在环保方面上的应用：随环境污染的日趋严重及其治理的日益迫切，磁性微球固定化酶在环境科学领域也将具有重要用途。Arica等对Fe3O4/P(MMA)微球固定化葡萄糖淀粉酶处理淀粉废水和造纸废水的催化处理效果进行了研究，探讨了反应时间和酶活力对反应的影响，结果显示固定化酶处理废水具有较大的优越性。164.前景展望用磁性微球作为固定化酶载体是固定化载体材料发展的必然趋势。作为一种新型载体，磁性高分子微球具有良好的应用前景，它受到了各国学者的高度重视，得到了广泛的研究。由于目前应用于固定化酶载体的材料各有优缺点，如天然高分子材料作为载体材料时具有无毒性、传质性能好等优点，但材料强度较低；合成有机高分子材料在作为载体材料时具有很强的灵活性，但传质性能较差；无机材料稳定性好、机械强度高、成本低，但用于固定化酶时，固定化率均比较低。与这些固定化材料相比，磁性微球具有在分离上的巨大优势，易回收、操作简便、成本较低，从经济效益方面来讲，磁性微球载体是工业化生产的最优选择。17但是，对于磁性微球固定化酶的研究，