猪病毒性腹泻灭活疫苗对仔猪保护力研究

自2011年底，由猪流行性腹泻病毒（porcinediarrheavirus，PEDV）GⅡ群引起的猪流行性腹泻（PED）在我国河南暴发以来，PEDVGⅡ快速蔓延至全国各大小猪场，目前已成为危害养猪业的三大传染病（ASF、PRRS、PED）之一。该病主要危害新生仔猪，临床表现为呕吐、水样腹泻、脱水、消瘦、死亡，以7日龄内仔猪发病最为严重，发病率与死亡率可高达100%。生长育肥猪感染后偶有发病，死亡率低，但可能长期排毒，是猪场发病的病毒来源之一。对于PED的防控，疫苗免疫是比较经济实惠的手段。猪流行性腹泻病毒属冠状病毒科（coronaviridae）冠状病毒属（coronavirus），核酸为线性单股正链RNA，基因组约为28kb，病毒粒子大小约为90～195nm。PEDV基因组编码的结构蛋白包括纤突蛋白（S）、小膜蛋白（E）、膜糖蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）。纤突蛋白（S）为主要的免疫原性蛋白，能诱导高水平的保护性抗体。为了给客户提供更加安全高效的产品，本研究小组坚持持续对猪病毒性腹泻灭活疫苗产品进行改进升级。目前通过提升抗原含量、保存抗原完整免疫原性及优化佐剂等，并评价其对仔猪的保护效力，结果表明其免疫效力显著提升，表明大华农公司将为客户提供更加优质的产品。1材料与方法1.1试验材料1）疫苗：竞品1与竞品2是从市场购买的同类产品；止泻威1、止泻威2由广东温氏大华农生物科技有限公司提供。2）细胞及主要试剂：Vero细胞为本实验室保存，DMEM培养基、胰蛋白酶和胎牛血清公司为Gibco产品。3）试剂盒：IgA试剂盒为IDEXX产品。

4）实验动物：怀孕70日龄一胎母猪（二元杂），从新兴某种猪场购得。5）攻毒毒株：MJ毒株，P5代，由广东温氏大华农生物科技有限公司提供。1.2方法1）试验分组：试验分组与免疫方案如表1。2）攻毒方案：对止泻威1、竞品1、竞品2免疫组及对照组所产5～7日龄哺乳仔猪进行攻毒，攻毒剂量为105.0TCID50/头，攻毒方式为口服。3）中和试验：①生长良好的Vero细胞用胰蛋白酶消化，用DMEM生长液分散后，稀释至5～8×105个/mL，最后将细胞加入96孔板中，0.1mL/孔，96孔板置于37℃、5%CO2培养；②待96孔板中Vero细胞生长至致密，用DMEM培养液洗涤细胞3次，200μL/孔/次，最后加入含适量胰蛋白酶DMEM培养液，100μL/孔；③用DMEM2倍系列稀释血清或乳汁至210，分别取100μL与100μL病毒液（1000TCID50/mL）混合，置于37℃、5%CO2孵育1h，每个稀释度重复4次；④去除步骤②中96孔板中培养液，每孔加入200μL血清或乳汁稀释液与病毒混合液，置于37℃、5%CO2孵育1h后，弃除，用DMEM培养液洗涤细胞3次，200μL/孔/次，最后加入含适量胰蛋白酶DMEM培养液，200μL/孔，置于37℃、5%CO2培养5～7d；⑤同时设病毒对照和阴性血清对照；⑥每日观察细胞病变效应（CPE）；⑦50%血清中和终点的计算：50%细胞不产生细胞病变（CPE）的血清稀释度。根据细胞病变程度，用Reed-Muench法计算50%血清中和滴度。4）抗体检测：IgG抗体与IgA抗体检测按照试剂盒说明书进行。2

结果2.1抗体检测结果1）血清中和抗体：该批母猪为一胎母猪，免疫前抗体小部分母猪为阳性（见图1中免疫前中和抗体结果）。将母猪随机分组进行2次免疫后，在二免后2周，从诱导血清中和抗体水平（见图2）来看，止泻威诱导中和抗体高于400，最高达512，且离散度低（小于10%），显著优于同时对比的两个竞品。2）初乳中SIgA抗体：采集产仔当天的乳汁（初乳），用IDEXX试剂盒检测其中的SIgA抗体，从检测结果（见图2）可以看出，止泻威诱导了高水平SIgA抗体，显著高于两个竞品。3）初乳中和抗体：通过检测初乳中和抗体（见图3）发现，止泻威免疫后诱导的中和抗体平均值达400以上，最高可达512，显著高于两个竞品。2.2哺乳仔猪被动保护在仔猪哺乳5～7d，采用野毒MJ株对其进行攻击，每头仔猪口服105

TCID50。在攻毒后24～48h，对照组、竞品1组、竞品2组仔猪均出现不同程度呕吐、腹泻，止泻威组在攻毒后3～5d仅个别仔猪出现轻微腹泻，各组仔猪腹泻率、存活率及存活弱仔率见表2。综合腹泻发病率、存活率及存活弱仔率，止泻威的保护效果显著高于两个竞品。3讨论与结论目前市售的疫苗主要有猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗及猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗两类疫苗，近几年为PED的防控做出了巨大的贡献。但是活疫苗免疫后能不同程度地排毒，排毒时间不一，增加猪场环境中的病毒载量，且活疫苗免疫后，猪只带毒时间长，虽然在配怀舍，不排毒，但进入产房后可能迅速排毒，导致初生仔猪感染发病。采用传统工艺制备的病毒性腹泻灭活疫苗，抗原含量有限（108.0~9.0

TCID50/mL），且常用的灭活剂能一定程度地破坏抗原表位，导致免疫原性降低（数据未发表），因此，病毒性腹泻灭活疫苗的免疫效力仍有提升的空间。本研究小组通过工艺改进有效提高了PEDV有效抗原含量，达200μg/mL，且筛选到能完整保留病毒结构的灭活剂，以此制备的疫苗经本研究评估验证，无论从二免疫