基因工程大实验

基因工程及分子生物学

大实验邢万金苏慧敏内蒙古大学生命科学学院生物系5/8/20241基因工程大实验一、实验目的学习基因操作的基本技术熟悉基因克隆常规仪器的使用学习科研项目的开题论证培养科学实验的独立操作能力建立做好原始实验记录的习惯练习撰写研究论文5/8/20242基因工程大实验二、教学组织学生自主设计方案教师审查方案可行学生独立实验操作教师现场巡回指导学生失败互相救助教师把关实验结果5/8/20243基因工程大实验三、实验内容目的基因的亚克隆、表达载体的构建、在大肠杆菌中诱导表达。5/8/20244基因工程大实验1.目的基因纳豆激酶成熟肽（NK）（原核）

位于pMD18-T-NK(full)

绿色荧光蛋白（EGFP）（真核）

位于pEGFP-N1上红色荧光蛋白（DsRed2）（真核）位于pDsRed2-1上其它基因（教师在研课题）5/8/20245基因工程大实验pMD18-T-NK(full):3.8kp纳豆激酶全长1181bpDNA已插入pMD18-T5/8/20246基因工程大实验2.载体pMD19-T（TA克隆）pUCm-T（TA克隆）pET-Trx（融合表达）pGEX-4T1（融合表达）克隆载体：表达载体：5/8/20247基因工程大实验pMD18/19-T5/8/20248基因工程大实验pUCm-T5/8/20249基因工程大实验pET-Trx3.3kbMCSAmpT7PT7RBS

TRX(his-patch)

CTCGAAGTTCTGTTTCAGGGTCCAGCAGGATCCGCAGAATTCAGCGCT

AGC

TAACATCATCATCATCATTAAGCTT

LeuGluValLeuPheGlnGlyProBamHIEcoRINheIHindIIIBamHIEcoRINheIstopHindIIIP3Ccutsite5/8/202410基因工程大实验pGEX-4T1pGEX-4T1~4950bpLacIAmpPtacGSTBamHI

EcoRI

SmaIXhoISalINotIGTCGTTCCGCGTGGATCCCCGGAATTCCCGGGTCGACTCGAGCGGCCGCATCGTGACTGALeuValProArgGlySerProGluPheProGlyArgLeuGluArgProHisArgAspThrombine5/8/202411基因工程大实验四、实验流程提取目的基因模板提取表达载体质粒PCR扩增目的基因EcoRI+BamHI双酶切回收T载体目的基因亚克隆载体EcoRI+BamHI双酶切回收目的基因片段目的基因表达载体IPTG诱导表达酶切鉴定酶切鉴定SDS检测感受态DH5α感受态BL21(DE3)5/8/202412基因工程大实验参考计划观察，转入清水，照相下午灌胶加样电泳，染色45min，脱色过夜上午第九天OD600=0.5时诱导表达3h，离心集菌下午早晨7：00摇菌[包括空BL21（DE3）]，练习组装SDS电泳模具上午第八天讲解实验论文写作要求下午提重组表达载体质粒，酶切验证，转化BL21(DE3)，涂平板过夜上午第七天挑重组表达载体转化克隆，摇菌过夜下午作感受态BL21(DE3)上午第六天摇BL21(DE3)下午“目的基因-表达载体”连接液转化DH5a，涂平板过夜上午第五天回收目的基因片段，与表达载体连接过夜下午提重组T载体，EcoRI和BamHI双酶切验证上午第四天挑重组T载体平板克隆，摇菌过夜下午上午第三天“目的基因-T载体”连接液转化涂板，回收pET-Trx，下午作感受态DH5a，EcoRI和BamHI双酶切并回收表达载体上午第二天PCR扩增目的基因，然后与克隆载体连接过夜，倒平板，摇DH5a下午提质粒（表达载体和目的基因模板质粒）上午第一天讲解仪器，发放移液器等，摇菌管和培养皿灭菌，摇表达载体和目的基因菌第零天下午5/8/202413基因工程大实验实验一质粒DNA的小量制备（1）提取目的基因载体（作PCR模板）pMD18-T-NK(full)pEGFP-N1pDsRed2-1（2）提取表达载体pET-Trx（备酶切）pET-TrxpGEX-4T15/8/202414基因工程大实验5/8/202415基因工程大实验实验二质粒DNA电泳鉴定5/8/202416基因工程大实验实验三质粒DNA的酶切37℃5/8/202417基因工程大实验实验四PCR扩增制备目的基因ddwater32μl10×PCRbuffer（不含MgCl2）5μl25mMMgCl23μl2.5mmol/LdNTP4μl10μmol/LPrimer12μl10μmol/Lprimer22μl

模板质粒1μl3U/μlTaq酶1μl（3u）总体积50μl1.PCR体系5/8/202418基因工程大实验2.PCR仪的循环程序设置：①94℃5min②94℃1min③60℃1min④72℃1min30s⑤goto②34cycles⑥72℃10min复性温度比引物的Tm值低2-5℃。5/8/202419基因工程大实验3.PCR产物电泳5/8/202420基因工程大实验实验五从琼脂糖凝胶中回收DNA片断表达载体T载体目的基因EBEBnoEB表达载体BamHI+EcoRIT载体+目的基因BamHI+EcoRI5/8/202421基因工程大实验实验六目的基因片段与载体连接表达载体BamHI+EcoRI目的基因BamHI+EcoRI重组表达载体T4ligase，14℃目的基因（PCR产物）T载体重组克隆载体14℃5/8/202422基因工程大实验实验七感受态菌的制备DH5a和BL21（DE3）4℃5/8/202423基因工程大实验实验八细菌转化42℃重组载体感受态菌37℃37℃5/8/202424基因工程大实验实验九转化克隆的筛选和鉴定提取质粒酶切37℃37℃5/8/202425基因工程大实验电泳鉴定结果载体目的基因PCR产物重组载体滞后BamHI+EcoRI5/8/202426基因工程大实验实验十外源基因的诱导表达OD600IPTG5/8/202427基因工程大实验实验十一SDS检测表达蛋白低分子量蛋白MarkerBL21(DE3)对照BL21(DE3)诱导4-8.重组表达载体诱导9.表达载体诱导20.1314366.297.41234567895/8/202428基因工程大实验树立质量法制观念、提高全员质量意识。2024/5/82024/5/8Wednesday,May8,2024人生得意须尽欢，莫使金樽空对月。2024/5/82024/5/82024/5/85/8/20249:23:45AM安全象只弓，不拉它就松，要想保安全，常把弓弦绷。2024/5/82024/5/82024/5/8May-2408-May-24加强交通建设管理，确保工程建设质量。2024/5/82024/5/82024/5/8Wednesday,May8,2024安全在于心细，事故出在麻痹。2024/5/82024/5/82024/5/82024/5/85/8/2024踏实肯干，努力奋斗。2024年5月8日2024/5/82024/5/82024/5/8追求至善凭技术开拓市场，凭管理增创效益，凭服务树立形象。08五月20242024/5/82024/5/82024/5/8严格把控质量关，让生产更加有保障。五月242024/5/82024/5/82024/5/85/8/2024作业标准记得牢，驾轻就熟除烦恼。2024/5/82024/5/808May2024好的事情马上就