微生物的生长规律

第二节微生物的生长规律一、微生物的个体生长和同步生长由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着技术上的困难。同步生长的概念：一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂的状态，称为同步生长（synchronousgrowth），进行同步分裂的细胞称为同步细胞。同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞学、生理学和生物化学等研究的良好材料5/8/20241微生物的生长规律获得同步生长的方法获得同步生长的方法主要有两类：环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细胞周期不同的周期变化。选择法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。5/8/20242微生物的生长规律Helmstetter-Cummings法原理：一些细菌细胞会紧紧粘附于硝酸纤维微孔滤膜上。步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培养。5/8/20243微生物的生长规律Figure5.

Thesynchronousgrowthofabacterial

population.

Bycarefulselectionofcellsthathave

justdivided,abacterialpopulationcanbe

synchronizedinthebacterialcelldivisioncycle.

Synchronycanbemaintainedforonlyafewgenerations.

Figure.synchronousgrowth5/8/20244微生物的生长规律二、微生物的群体生长☆无分支单细胞微生物主要包括细菌和酵母菌，其群体生长是以群体中细胞数量的增加来表示的。☆由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称为世代，一个世代所需的时间就是代时（Ｇenerationtime,G），代时也就是群体细胞数目扩大一倍所需时间，有时也称为倍增时间。☆右图表示的是一个细胞经过若干代分裂后的情况。右图可见，每经过一个代时，细胞数目就增加一倍，呈指数增加，因而被称为指数生长，这就是单细胞群体生长的特征。

1.无分支单细胞微生物的群体生长特征5/8/20245微生物的生长规律Bydefinition,bacterialgrowthiscellreplication–i.e.,growthoftheculture.Mostspeciesofbacteriareplicatebybinaryfission,whereonecelldividesinto2cells,the2cellsinto4,the4into8,etc.Ifthiscelldivisionoccursatasteadyrate–suchaswhenthecellshaveadequatenutrientsandcompatiblegrowingconditions–wecanplotnumbersofcellsvs.timesuchasonthegraphatright.Beforetoolong,wewillneedtoextendthepaperverticallyasthepopulationcontinuestodouble.Foraculturewherecellsdivideevery20minutes,onecellcanresultin16,777,216(i.e.,224)cellsafterjust8hours–barringnutrientdepletionorothergrowth-alteringconditions.1.无分支单细胞微生物的群体生长特征5/8/20246微生物的生长规律Ifweweretoconvertourverticalaxistoalogarithmicscale–asonthegraphatright–wewillnotneedasmanysheetsofgraphpaper,andwewillfindthatasteadyrateofgrowthisreflectedasastraightline.(Ontheverticalaxis,thesamedistanceonthepaperiscoveredwitheachdoubling.)Thistypeofgraphpaperiscalledsemilogarithmicgraphpaperonwhichwewillbeplottingourclassresults.Thenumbersweplotwillfallonthegraphatthesameplacethelogarithmsofthesenumberswouldfallwhenplottedonconventionalgraphpaper.5/8/20247微生物的生长规律Theexampleatrightshowsthetypeofgraphwemayobtainfromourclassdata.Wecanplotbothcolony-formingunits(CFUs)permlandabsorbanceonthesamegraph,rememberingthattheabsorbanceunitsshouldalsobeonalogarithmicscale.Ratherthan"connectingthedots,"wedrawthebeststraightlineamongourCFU/mlplotstorepresentthephasesofgrowth–lag,exponential,andthestartofthemaximumstationaryphase.5/8/20248微生物的生长规律指数生长可以用下式表示：

b=B×2nB,b和t可由试验获得，n可通过上式计算得出，将等式两侧取对数重排后得：lgb=lgB+nlg2lgb-lgBlgb-lgB

lg20.301式中：B为起始师细胞数目，

b为指数生长某个时刻t时的细胞数目，

n为世代数=指数生长n=5/8/20249微生物的生长规律例如：一培养液中微生物数目由开始的12，000（B），经4h（t）后增加到49，000，000（b），这样，n＝(lg4.9×107－lg1.2×104）÷0.301＝12★借助于n和t，还可以计算出不同培养条件下的代时G，

G＝t/n在本例中，G＝4×60/12＝20min∴该种微生物的代时为20分钟。在4小时内共繁殖了12代。5/8/202410微生物的生长规律★代时能够反应细菌的生长速率，代时短，生长速率快，代时长，生长速率慢。在很多微生物学研究中常常要了解微生物的代时。★代时在不同种微生物中的变化很大，多数微生物的代时为1~3h,然而有些快速生长的微生物的代时还不到10min,而另一些微生物的代时却可长达几小时或几天；另外，同一种微生物，在不同的生长条件下其代时的长短也不同；但是，在一定条件下，每一种微生物的代时是恒定的，因此它是微生物菌种的一个重要特征。5/8/202411微生物的生长规律一些细菌的代时菌名培养基培养温度代时E.coli（大肠杆菌）肉汤37℃17minE.Coli牛奶3712.5Enterobacteraerogenes（产气肠细菌）肉汤或牛奶3716~18E.aerogenes组合3729~44B.Cereus（蜡状芽孢杆菌）肉汤3018B.thermophilus（嗜热芽孢杆菌）肉汤5518.3Lactobacillusacidophilus（嗜酸乳杆菌）牛奶3766~87Streptococcuslactis（乳酸链球菌）牛奶3726S.lactis乳糖肉汤3748Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌）肉汤3723.5Azotobacterchroococcum（褐球固氮菌）葡萄糖25344~46Mycobacteriumtuberculosis（结核分枝杆菌）组合37792~93Nitrobacteragilis（活跃硝化杆菌）组合2712005/8/202412微生物的生长规律BacteriumMediumGenerationTime(minutes)EscherichiacoliGlucose-salts17Bacillus

megateriumSucrose-salts25Streptococcus

lactisMilk26StreptococcuslactisLactosebroth48StaphylococcusaureusHeartinfusionbroth27-30LactobacillusacidophilusMilk66-87Rhizobium

japonicumMannitol-salts-yeastextract344-461MycobacteriumtuberculosisSynthetic792-932TreponemapallidumRabbittestes1980Table.Generationtimesforsomecommonbacteriaunderoptimalconditionsofgrowth.

5/8/202413微生物的生长规律

不同温度下的代时温度对微生物的代时有明显影响：E.Coli在不同温度下的代时温度（℃）代时（分）温度（℃）代时（分）10860352215120371720904017.525404520302947.5775/8/202414微生物的生长规律G(generationtime)=t(time,inminutesorhours)/n(numberofgenerations)G=t/nG=generationtime(timeforthecellstodivide)t=timeintervalinhoursorminutesB=numberofbacteriaatthebeginningofatimeintervalb=numberofbacteriaattheendofthetimeintervaln=numberofgenerations(numberoftimesthecellpopulationdoublesduringthetimeinterval)b=Bx2n(Thisequationisanexpressionofgrowthbybinaryfission)G=t/nSolveforn:n=logB+nlog2n=logb-logB

log2n=logb-logB

.301n=3.3logb/BG=t/nSolveforGG=

t

3.3logb/BCalculationofGenerationTime5/8/202415微生物的生长规律Example:Whatisthegenerationtimeofabacterialpopulationthatincreasesfrom10,000cellsto10,000,000cellsinfourhoursofgrowth?

G=

t

3.3logb/BG=

240minutes

3.3log107/104

G=

240minutes

3.3x3G=24minutes

5/8/202416微生物的生长规律2.无分支单细胞微生物的群体生长曲线☆以细菌为例介绍无分支单细胞微生物群体生长规律，其结论也基本适用于酵母菌。☆生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、分裂直至死亡的整个动态变化过程。☆每种细菌都有各自的典型生长曲线，但它们的生长过程却有着共同的规律性。一般可以将生长曲线划分为四个时期。5/8/202417微生物的生长规律将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。生长曲线的制作5/8/202418微生物的生长规律典型的生长曲线

（Growthcurve）延滞期对数期稳定期衰亡期时期的划分：按照生长速率常数（growthraceconstant）不同5/8/202419微生物的生长规律一条典型的生长曲线至少可以分为迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期等四个生长时期。5/8/202420微生物的生长规律.

5/8/202421微生物的生长规律其它名称：停滞期、调整期、适应期1.现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。2.特点：生长速率常数=0细胞形态变大或增长细胞内RNA特别是rRNA含量增高，原生质嗜碱性增强合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生诱导酶对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素等化学药物）3.原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物①延滞期（lagphase）5/8/202422微生物的生长规律◆菌种：繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短；◆接种物菌龄：用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期；◆接种量：一般来说，接种量增大可缩短甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用1/10的接种量）；◆培养基成分：

在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；

接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。★影响延迟期长短的因素5/8/202423微生物的生长规律认识延迟期的特点及形成原因对实践的指导意义◆在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期采取的缩短lagphase的措施有：①增加接种量；（群体优势----适应性增强）②采用对数生长期的健壮菌种；③调整培养基的成分，在种子基中加入发酵培养基的某些成分。④选用繁殖快的菌种◆在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌5/8/202424微生物的生长规律②对数期（logarithmicphase）其他名称：指数期现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。

特点：生长速率常数最大，即代时最短细胞进行平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等比较一致代谢最旺盛细胞对理化因素较敏感影响因素：菌种营养成分营养物浓度﹡培养温度5/8/202425微生物的生长规律应用意义①由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄；②发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度③食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期④是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。5/8/202426微生物的生长规律营养物浓度与对数期生长速率和产量作用方式：影响微生物的生长速率和总生长量生长限制因子：凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物就称生长限制因子8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml0.1mg/ml只最大收获量受影响生长速度和最大收获量受影响时间细胞数或菌体量5/8/202427微生物的生长规律③稳定期（stationaryphase）又称：恒定期或最高生长期特点：①新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，微生物的生长速率处于动态平衡，培养物中的细胞数目达到最高值。②细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽孢。③此时期的微生物开始合成次生代谢产物，对于发酵生产来说，一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。产生原因：

营养物尤其是生长限制因子的耗尽营养物的比例失调，如碳氮比不合适;有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）物化条件（pH、氧化还原势等）不合适;5/8/202428微生物的生长规律应用意义：1）发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：补充营养物质（补料）调pH调整温度2）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。生长产量常数（Y，或生长得率，growthyield）：概念：表示微生物对基质利用效率的高低Y=菌体干重/消耗营养物质的浓度

根据产量常数可确定微生物对营养物质的需要量如：Y=0.5，表示要得到5g菌体，需某营养物（葡萄糖）10g。Y=x–x0C0

–C=x–x0C05/8/202429微生物的生长规律④衰亡期（declinephase）特点①细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现“负生长”。②细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽孢开始释放。③因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、自溶等，发生自溶的菌生长曲线表现为向下跌落的趋势。衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条件有关。产生原因生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡5/8/202430微生物的生长规律lg细胞数或产物浓度时间细胞产物I型 II型3.微生物生长与代谢产物形成的关系微生物发酵形成产物的过程与微生物细胞生长的过程并不总是一致的。一般认为：初级代谢是给予生物能量和生成中间产物的过程，初级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程同步，微生物生长的稳定期是这些产物的最佳收获时机；次级代谢产物与微生物的生存、生长和繁殖无关。次级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程不同步。在分批培养中，它们的形成高峰往往在微生物生长稳定期的后期或衰亡期。5/8/202431微生物的生长规律4.丝状微生物的群体生长丝状微生物的纯培养采用孢子接种，在液体培养基中震荡培养或深层通气加搅拌培养，菌丝体通过断裂繁殖不形成产孢结构。可以用菌丝干重作为衡量生长的指标，即以时间为横坐标，以菌丝干重为纵坐标，绘制生长曲线。可分为三个阶段：1、生长停滞期2、迅速生长期3、衰退期5/8/202432微生物的生长规律1、生长停滞期:造成生长停滞的原因一是孢子萌发前真正的停滞状态，另一种是生长已经开始，但还无法测定。2、迅速生长期:菌丝体干重迅速增加，其立方根与时间呈直线关系，菌丝干重不以几何级数增加，没有对数生长期。生长主要表现在菌丝尖端的伸长和出现分支、断裂等，此时期的菌体呼吸强度达到高峰，有的开始积累代谢产物。3、衰退期:菌丝体干重下降，到一定时期不再变化。大多数次级代谢产物在此期合成，大多数细胞都出现大的空泡。有些菌丝体还会发生自溶菌丝体，这与菌种和培养条件有关。丝状微生物的群体生长分期

5/8/202433微生物的生长规律连续培养（continuousculture）分批培养（batchculture）：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。连续培养（continuousculture）：在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。连续培养理论基础：由于对典型生长曲线中稳定期到来原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临，从而发展出现在的连续培养技术。5/8/202434微生物的生长规律原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。单批培养恒浊法恒化法单批培养 连续培养 时间连续流入新鲜培养液lg细胞数（个/ml）连续培养连续培养原理5/8/202435微生物的生长规律按控制方式分按培养器的级数分按细胞状态分

按用途分内控制（控制菌体密度）：恒浊器外控制（控制培养液流速、以控制生长速率）：恒化器单级连续培养器多级连续培养器一般连续培养器固定化细胞连续培养器实验室科研用：连续培养器发酵生产用：连续发酵罐连续培养器5/8/202436微生物的生长规律连续培养技术——恒化连续培养概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、生长因子等），使其始终成为生长限制因子，而达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。特点