8外源化学物致突变作用8-2省公开课金奖全国赛课一等奖微课获奖课件

第七章

外源化学物致突变作用

1/57案例3分析讨论镰刀型细胞贫血是遗传物质DNA中血红蛋白基因序列中一个CTT变成CAT，即发生基因颠换，血红蛋白β链中N端第六位氨基酸由Glu变为Val，血红蛋白分子发生遗传缺点，以至产生病变。这种疾病能够遗传。经过这个案例，首先了解从碱基改变，到编码产物改变，再到表现型改变最终到健康效应出现之间因果关系。另首先要认识到基因突变发生会引发严重健康危害。2/57第四节

机体对致突变作用影响3/57遗传物质在外源性原因损伤仍能

代代相传原因：DNA可执行高保真度复制，对复制中错误能及时修复，从而到达高度保真。细胞能够经过对DNA损伤修复而保护亲代DNA链，使之防止因为内、外各种原因损伤而发生改变。4/57一、DNA损伤修复（一）直接修复：依赖酶作用。光复活：依赖光过程，经过光裂合酶切下DNA上嘧啶二聚体，将毗连嘧啶接回原结构上。能够完全修复紫外线诱发嘧啶二聚体，使其在原位上恢复为单体。“适应性”反应：经过烷基转移酶修复DNA烷化损伤，保护细胞免受烷化剂毒性影响。5/57（二）碱基切除修复

DNA糖基酶作用于受损DNA，识别并切除损伤碱基，经过切断碱基与脱氧核糖连接键，使受损碱基脱落，留下一个无嘌呤或无嘧啶AP位点。AP内切酶将DNA链切断，由聚合酶和连接酶完成修复过程。

碱基切除修复是细胞对碱基氧化损伤主要防御系统。6/57（三）核苷酸切除修复

使细胞含有从DNA上移除较大损伤。全部生物体最常见修复机制。基本能够修复全部种类DNA损伤。

过程：内切酶，①损伤识别；②损伤两侧切除损伤链；③切除寡聚核苷酸；④修复合成填补产生缺口；⑤DNA连接酶封闭，恢复原有DNA序列。

7/57（四）双链断裂修复

未修复双链断裂开启DNA损伤反应系统，使细胞阻滞于周期某一期或诱发细胞凋亡。

不是修复，是一个耐受过程，以容忍损伤继续存在和高突变率情况来换取细胞继续生存耐受过程。8/57

（五）交联修复：

当细胞内发生DNA链内交联，会造成双链断裂，机体开启无误交联修复或易误交联修复。9/57小结修复结果不全是有益。修复路径是各种。修复与突变不可分。损伤－修复－突变10/57二、遗传原因对致突变作用影响（一）代谢酶遗传多态性1、氧化代谢酶

芳烃羟化酶：催化多环芳烃等致癌物活化。2、酯酶

环氧水化酶：活化酶，参加苯并（a）比代谢为终致癌物。3、谷胱甘肽硫转移酶

缺乏易患肺癌11/57（二）修复功效个体差异

修复酶多态性造成机体对损伤反应不一。

1、O6－甲基鸟嘌呤－DNA－甲基转移酶：功效：恢复碱基原有配对性。缺乏或活性降低：肿瘤发生

2、聚（二磷酸腺苷－核糖）多聚酶：功效：氧化损伤修复方式，对外来原因造成基因突变和肿瘤发生可产生抑制或促进作用。12/57小结遗传原因是化学毒物作用靶部位，是决定化学毒物毒作用性质和强度一个主要原因。遗传原因对致突变作用影响研究，是预防和治疗肿瘤新思绪。13/57第五节观察外源化学物致突变作用基本方法***14/57致突变试验应用中国预防医学博士张学明:煎炸鱼中合有强致癌物－－杂环胺。杂环胺形成量主要受煎炸、烤温度影响，其次是煎烤时间。煎炸温度小于200℃，杂环胺形成量就极少；假如煎炸温度超出200℃，煎炸时间少于2分钟，杂环胺形成量也极少；在煎炸鱼外面挂上一层淀粉糊再炸，也能预防杂环胺形成。美国加州科研人员发觉，高温烹调或油炸肉食中合有突变源，对经过高温烹调牛肉、鸡、鱼等进行检验，结果测出10种致癌化合物，这次研究证实，突变源不是因为炭火等热源将肉烧糊所致，而是肉食本身成份在加温200℃以上时产物。

15/57检测化学物致突变性目标：判定生殖细胞和体细胞致突变物；预测潜在致癌物环境致突变物监测与评价。16/57一.观察项目标选择（一）观察效应终点类型遗传学终点(geneticendpoint)：

－基因突变和染色体畸变检测可直接反应外源化学物致突变性，是评价化学物致突变性唯一可靠方法。有许多试验所观察到现象并不反应基因突变,染色体畸变和染色体分离异常,而仅反应致突变过程中发生其它事件。所以，将试验观察到现象所反应各种事件统称为遗传学终点。

包含：基因突变，染色体畸变，染色体组畸变，DNA原始损伤

17/57（二）成套观察项目1.标准①选择遗传毒性试验应包含每一类型遗传学终点。②应包含各种进化程度不一样物种,如原核细胞,低等和高等真核细胞。③体内试验与体外试验配合。

18/572.HIC(1997)对于药品遗传毒性评价提议试验组合为：细菌基因突变试验体外哺乳动物细胞染色体畸变试验或体外小鼠淋巴瘤细胞tk试验；体内啮齿类造血细胞染色体损伤试验；对标准致突变试验组合结果深入研究时，能够选择其它一些试验，如DNA加合物测定、DNA链断裂检测、DNA修复试验等。19/57二、惯用致突变试验

细菌回复突变试验

微核试验

染色体畸变分析

姐妹染色单体交换试验

果蝇伴性隐性致死试验

显性致死试验

程序外DNA合成试验

单细胞凝胶电泳20/57(一)细菌回复突变试验－Ames试验***是利用突变体测试菌株，观察受试物能否纠正或赔偿突变体所携带突变改变，判断其突变型。惯用指示菌株：鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌。广泛应用鼠伤寒沙门菌突变试验。21/57

(一)细菌回复突变试验－Ames试验***

1.原理：是人工诱变突变株在组氨酸操纵子中有一个突变，突变菌株必需依赖外源性组氨酸才能生长，而在无组氨酸选择性培养基上不能存活。致突变物可使其基因发生回复突变，使它在缺乏组氨酸培养基上也能生长。计算诱发回复菌落数即可判断化学毒物致突变性。22/57

2.惯用菌株：鼠伤寒沙门菌组氨酸缺点型突变株为指示微生物。当前推荐使用

TA100TA102TA97TA98

为增强对诱变物敏感性加入一些附加突变：试验中可供选取测试菌株有各种，所携带突变在不一样基因中，各有不一样特征，有测定碱基置换，有测定移码突变，有二者都可测定，依据试验目标配套选择。23/57(一)Ames试验3.方法：点试法：用作定性试验，适合用于短期大量筛选

阳性阴性表层培养基＋指示菌±S9培养48小时受试物10μl24/57平板掺入法：标准试验，用作定量测定

培养48小时阳性阴性表层培养基＋指示菌±S9＋受试物25/57(二)微核试验(micronucleustest,MNT)观察受试物产生微核发生率或有微核细胞率为观察指标检测化学物染色体损害能力试验，DNA断裂剂，非整倍体诱变剂。微核（micronucleus）

：染色体或染色单体无着丝点断片或因纺锤体受损伤而丢失整个染色体，在细胞分裂后期仍留在子细胞胞质内，单独形成一个或几个规则次核，包含在子细胞胞质内，比主核小。26/57

正常细胞、微核细胞27/57

正常细胞、微核细胞和核异常细胞

指示正常细胞；指示微核细胞；指示核异常细胞（2.5×100）28/57骨髓多染红细胞微核试验

大多数类型细胞都可形成微核，但有核细胞胞质少，微核与正常核叶及核突起难以判别。常规：骨髓多染红细胞微核试验

多染红细胞是成红细胞发展为成熟红细胞时，主核已排出，微核仍保留在细胞质中，成为多染红细胞（polychromaticerythrocytesPCE）,这些细胞保持其嗜碱性约24小时，然后成为正染红细胞，并进入外周血。计数骨髓有微核多染红细胞率可判断受试物对骨髓细胞染色体损伤作用。29/57骨髓细胞微核试验不足一些化学物在骨髓难以抵达有效浓度。骨髓中SCE是动态平衡，其不停成熟为红细胞，红细胞又衰老死亡。化学物毒物主要在肝脏活化，其活化中间产物可能在抵达骨髓之前消失。仅观察体细胞其结果外推其它组织应慎重。30/57微核试验进展体外微核试验：中国仓鼠肺细胞/中国仓鼠卵巢细胞/中国仓鼠成纤维细胞，易于操作和控制受试物浓度。外周血微核试验：可能成为人群观察化学毒物遗传毒性一个伎俩。双核细胞法：提升微核灵敏度。免疫荧光染色法、荧光原位杂交：灵敏度高，还可判断起源（断片还是染色体）。31/57(三)染色体畸变分析

chromosomeaberrationassay观察染色体形态结构和数目改变，又称细胞遗传学试验。观察：用显微镜检验细胞分裂中期相染色体畸变和染色体分离异常。结果：裂隙，断裂，断片，微小体，染色体环等。32/57常染色体异常Downsyndrome

(trisomy21):先天愚型或唐氏综合征

33/57三体综合征（13三体）：严重眼，脑，循环系统缺点以及腭裂。儿童生活极少超出几个月。34/57(四)姐妹染色单体交换试验(sister-chromatidexchange,SCE)

指染色体同源座位上DNA复制产物相互交换,其频率与DNA断裂和修复相关。检测DNA损伤灵敏指标。原理：在细胞培养液中加入5-溴脱氧尿嘧啶（5-BrdU，嘧啶类似物），在DNA合成期可与胸苷竞争掺入DNA中，经两个分裂周期后，两条染色单体，其中一条DNA链双链内T被5-溴脱氧尿嘧啶核苷取代，另一条只有一条链被取代。用染色剂处理，使双链含BrdU染色单体着色浅淡，单链含BrdU染色单体着色深。当姐妹染色单体间发生同源片段交换时，就能够依据每条染色单体夹杂着深浅不一着色片段加以区分。35/57(五)果蝇伴性隐性致死试验

原理

依据隐性基因在伴性遗传中交叉遗传特征，即雄蝇X染色体传给F1代雌蝇。又经过F1代传给F2代雄蝇。位于X染色体上隐性基因能在半合子雄蝇中表现出来。据此推断致死突变存在。结果：

能检出点突变，小缺失，重排。优点：判断突变终点客观、不需活化。不足：与哺乳动物差异较大。36/57(六)显性致死试验

1.原理对雄性动物染毒，观察一个精子发育周期中各个阶段雌鼠出现受精卵在着床前死亡和胚胎早期死亡。致突变物引发哺乳动物生殖细胞染色体发生结构和数目改变。2.检测整体哺乳动物生殖细胞遗传性（染色体畸变）损伤方法。是评价化学毒物对雄性动物生殖细胞遗传毒性很好方法之一。不足：灵敏度差，动物数量大，一定受孕率。37/57（七）程序外DNA合成试验

(unscheduleDNAsynthesis，

UDS)当DNA受损伤时，损伤修复DNA合成主要在S期以外其它细胞周期，称程序外DNA合成

**。原理：观察分离或培养细胞，加入标识DNA合成原料，如3H-胸苷，测定S期以外3H-胸苷掺入胞核量，判断受试物是否造成DNA损伤。所以发觉UDS增高，即表明DNA发生过损伤。38/5739(八)单细胞凝胶电泳试验(singlecellgelelectrophoresis，SCGE)（彗星试验(cometassay)）一个快速检测哺乳动物细胞DNA损伤试验方法。

原理：DNA损伤后，断裂DNA片段比大片段DNA迁移更加快，电泳后出现彗星状，即可判断DNA损伤。

细胞DNA不一样损伤程度彗星电泳图

依据“彗星”尾部占头部大小百分比将细胞损伤分为：0-无损伤<5%Ⅰ-轻度损伤5%-20%Ⅱ-中度损伤21%-40%Ⅲ-重度损伤41%-95%Ⅳ-完全损伤>95%39/57几个遗传毒理学试验哺乳动物性细胞

致突变物筛检可靠性评价

试验灵敏性(%)特异性(%)准确性(％)

Ames试验17/19(89%)3/10(30%)20/29(69%)

骨髓细胞染色体畸18/18(100%)2/10(20%)20/28(71%)

变试验或微核试验显性致死试验18/18(100%)8/10(80%)26/28(93%)40/57惯用遗传毒理学试验特点试验指示生物细胞类型染毒路径遗传学终点细菌回复突变试验原核-体外基因突变哺乳动物细胞基因突变试验哺乳动物细胞体细胞体外基因突变染色体畸变试验哺乳动物细胞体细胞体外染色体损伤哺乳动物：骨髓体细胞体内染色体损伤哺乳动物：睾丸性细胞体内染色体损伤微核试验哺乳动物：骨髓体细胞体内染色体损伤/非整倍体显性致死试验哺乳动物性细胞体内染色体损伤程序外DNA合成试验哺乳动物：大鼠肝体细胞体内DNA损伤姐妹染色单体交换试验哺乳动物细胞体细胞体外DNA损伤41/57（九）观察方法新进展（自学）

1.转基因小鼠致突变检测系统

2.微核自动化检测技术

3.荧光原位杂交技术

42/57致突变试验应用实例——怎样设计？分组（化合物）选择致突变试验组合体外，体内观察遗传学终点做出评价43/57致突变试验应用实例44/5745/5746/57致突变试验应用实例——空气污染家庭装潢有害气体致小鼠遗传毒性试验

47/57三、致突变试验中一些问题（一）阴性和阳性对照设置阴性对照

－为了获取试验基础数据。阳性对照

－证实试验方法可靠；验证试验者在本试验条件下，完成技术和判定致突变物能力；证实经一段时间后，本试验重复性。48/57

(二)体外试验活化系统

1．哺乳动物细胞介导使用完整细胞，尤其是大鼠肝原代细胞，与测试细菌或细胞一起培养。

特点：这也是一个活化系统。它有完整细胞结构和各种酶及内源性辅助因子，代谢能力优于无细胞系统如S9。

不足：但不如体内活化系统。

49/57

2．S9

S9指经酶诱导剂处理后制备肝匀浆，再经9000g离心分离所得上清液，加上适当缓冲液和辅助因子。

特点：它主要含有混合功效氧化酶(MFO)，是国内常规应用于体外致突变试验代谢活化系统。

缺点：S9随试验动物种属或器官不一样而有差异；S9含有大量亲核物质有可能影响试验敏感性。

50/573．纯化酶和基因工程纯化酶：应用纯化细胞色素P-450、谷胱苷肽转移酶及过氧化物水解酶，可严格控制代谢产物诱发突变条件，但技术难度大。

基因工程：将人细胞色素P-450基因，插入组合细胞内，用上述细胞进行致突变试验，使细胞含有代谢活化系统。

不足：不可能完全取代整体动物代谢。

51/57

（三）致突变试验与致癌试验关系已知致突变作用是致癌机制之一。利用致突变试验预测致癌性