毛细管电泳原理及分析策略

1毛细管电泳原理及分析策略5/9/20242毛细管电泳原理及分析策略5/9/20243毛细管电泳原理及分析策略5/9/20244毛细管电泳原理及分析策略5/9/20245毛细管电泳原理及分析策略5/9/20246毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024进样方式压力进样电动进样浓缩进样7毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024毛细管种类非涂层毛细管（裸管）内壁涂层毛细管（涂层管）8毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024非涂层毛细管-电渗流的概念9毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024-H+高pH低pH10毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024电渗流的特点EOF11毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024-+纯电泳状态12毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024-+EOF电泳+电渗流0tm(min)13毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024电渗流的作用14毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024电渗流的活塞流特点HydrodynamicflowParabolicResistancetoflowatsurfaceMorediffusion/broaderdetectionzoneEOFgivesplugflowMinimizesbandbroadeningNarrowsdetectionzone15毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024HydrodynamicflowParabolicResistancetoflowatsurfaceMorediffusion/broaderdetectionzoneEOFgivesplugflowMinimizesbandbroadeningNarrowsdetectionzone电渗流的活塞流特点16毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024电渗流是CE中最大的驱动力来源之一17毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024电渗流的正面及负面作用正面作用增加分离速度使得正、负电荷物质同时分离负面作用减少分离时间和分离有效距离电渗流的波动极大的影响了迁移时间的重复性18毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024影响电渗流的因素pH值

pH越高，电渗流越大离子强度离子强度越高，电渗流越小缓冲溶液添加剂离子型表面活性剂、有机溶剂、环糊精19毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024电渗流随pH的变化情况20毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024控制电渗流的三个重要手段采用涂层毛细管，消除电渗流的影响改变pH，从而调整电渗流的大小。pH<3时电渗流很低；当pH>10以后，电渗流基本不增加添加剂：有机溶剂可以降低电渗流的大小，从而增加分离的有效距离；表面活性剂可以彻底改变电渗流的方向和大小，主要是在阴离子分析时使用21毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024缓冲溶液的影响和选择在CE中应该根据以下性质来选择缓冲溶液：在所选的pH范围内有较强缓冲能力；在检测波长处有低的紫外吸收；小的淌度（即大体积、低电荷离子）以降低所产生的电流。那些被称为生物“优良缓冲液”的，如Tris,borate,CAPS等特别有用，因为这些缓冲溶液中的离子一般较大，能够在较高浓度下使用而不会产生大的电流，但一个潜在的缺点是这些大的缓冲离子有强的紫外吸收。22毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024常用的CE缓冲体系磷酸钠体系宽缓冲范围硼酸钠体系高pH范围Tris-HCl体系低pH范围醋酸-醋酸铵体系CE/MS常用体系23毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024CZE分离条件的选择毛细管类型--涂层还是非涂层？毛细管长度--长毛细管还是短毛细管？缓冲液体系--种类和pH值添加剂类型--甲醇|环糊精|乙腈检测器选择--紫外|二极管阵列|激光诱导荧光24毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024缓冲溶液的选择

可先用磷酸缓冲体系为搜寻基础，初步确定（最佳）pH范围后，再进一步细选出更好pH和缓冲试剂。磷酸盐是毛细管电泳中最常用的缓冲体系之一，它的紫外吸收低，pH缓冲范围比较宽（pH=1.5～13），但电导也比较大。25毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024缓冲溶液及pH值的选择

研究经验表明：对于蛋白质、肽和氨基酸等两性样品，采用酸性（pH2）或碱性（pH＞9）分离条件，比较容易得到好的分离结果；糖类样品通常在pH=9～11之间能获得最佳分离；羧酸或其他样品多在pH=5～9之间选择分离条件。26毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024缓冲溶液及pH值的选择pH的选择也和所用的毛细管种类有关，许多涂层毛细管只能在一定的pH范围内工作，例如聚丙烯酰胺涂层毛细管，在3＜pH＜8的范围以外工作，其涂层容易水解失效。27毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024缓冲溶液及pH值的选择在相同的pH下，不同缓冲体系的分离效果不尽相同，有的可能相差甚远。一般的经验是，能与样品发生相互作用的试剂，有可能就是最好的试剂。一个典型的例子是，在分离糖类和DNA等分子时优先使用硼酸盐缓冲体系，因为硼酸根能与糖羟基形成配位键，从而增加糖的负电荷和分离度。硼酸缓冲试剂也适用于其他含邻位羟基或多羟基化合物的分离。28毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024缓冲溶液及pH值的选择

缓冲试剂及pH调节剂的浓度也需要优化。缓冲试剂的浓度一般控制在10～200mmol/L之间。电导率高的缓冲试剂如磷酸盐和硼砂等，其浓度多控制在20mmol/L附近，而电导小的试剂如硼酸及HEPES等，其浓度可在100mmol/L以上。有时为了抑制蛋白质吸附等特殊目的，可采用很高（＞0.5mol/L）的试剂浓度，此时要注意减少分离电压，分析速度自然也将随之降低。29毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024添加剂的选择目的：改善分离抑制分析物在毛细管上的吸附30毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024添加剂的选择甲醇|乙腈（5-50%）降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果增加非极性物质的水溶性环糊精|SDS等表面活性剂增加分离选择性，提高分析效果降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果非极性高分子聚合物掩蔽毛细管内壁电荷，抑制分子吸附降低电渗流形成一定的分子筛，提高分子大小选择性31毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024第二章毛细管胶束电动色谱电解质中加入表面活性剂(surfactant，例如SDS)，使之形成胶束（Micelle），样品根据其疏水性(Hydrophobicity)强弱的差异，在胶束与电解质的分配系数有所不同來进行分离

，样品疏水性愈強，则进入胶束的机会愈大。通常物质进入胶束后，泳动的速度会变慢，因此疏水性愈強的物质则愈慢出來。32毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024毛细管胶束电动色谱原理33毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024SDS34毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024-+EOFMicellarElectrokineticChromatography(MEKC)35毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024七种青霉素的分离CZE:20mM

Pi-Borate,pH8.5(B)MEKC:0.1MSDSin(A)soln.36毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024胶束电动色谱的特点优点增加对弱极性物质分离的分离度在中药分析、天然产物分析、农药分析中经常使用缺点稳定性不佳，达到好的重复性比较困难37毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024第三章毛细管凝胶电泳

毛細管內先填充凝胶(例如polyacrylamide或cellulose)，此时凝胶会在毛細管內形成分子筛，样品依分子量的大小在毛細管內移动速度不同而进行分离。主要用于核酸片断及蛋白分子量分析38毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024毛细管凝胶电泳39毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024CE双链及单链核酸分析45-寡核苷酸质控1.02.03.0123456789101112131415161718192023242526272829303031323334IS2110.015.0RelativeFluorescenceIntensitydsDNA片段

(72bp-12Kbp)40毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024CE-SDS蛋白分子量分析41毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024第四章毛细管等电聚焦42毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024第五章亲和毛细管电泳

-分离条件基于CZE当在CZE样品或缓冲液中引入抗原或抗体时，便可以用于研究和分析抗体或抗原，也可以利用这种方法对电泳峰进行特异性定性。显然除抗原与抗体的选择需要应用生化知识外，其他方面的选择与CZE等相同。用于研究分子间相互作用测定，分子构型变化特定物质检测活性物质筛选43毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024ACE测定分子间结合常数与解离速率JAK2与SH2-B之间的相互作用研究44毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024ACE特定物质的检测45毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024ACE用于相互作用筛选适体Aptamer类似于抗体，但可以体外合成，结合常数比抗体更高，有广泛的药物筛选和临床诊断应用潜力目前已有以下的一些蛋白的aptamer是采用CE方法筛选得到的IgEHIVtype1reversetranscriptaseThrombinAnti-thrombinIIITaqDNApolymerase46毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024ACE用于相互作用筛选传统筛选方法如亲和色谱或者CEC筛选一个Aptamer需要4-6周而CE只需要几天就可以了，大大提高了筛选速度--MicroScaleBioseparations201947毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024第六章检测器选择小分子检测大分子检测48毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024CE检测器种类及性能49毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024小分子检测有紫外吸收首先选择二极管阵列检测器或紫外检测器无紫外吸收可以衍生化的，可以采用自外衍生的方法再用紫外检测器检测，如氨基酸、还原性糖等不可以衍生化的，可采用间接紫外法用紫外检测器检测，也可以尝试电化学检测器有荧光或需要高灵敏度检测的可采用LIF检测器需要测定结构或者难以用光学检测器检测的，可以考虑质谱检测50毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024大分子检测蛋白、核酸可以首先选择紫外检测器如果需要高灵敏度检测可以采用柱前或者柱上衍生的方法标记荧光，然后用LIF检测如果需要特异性检测，可使用特异性荧光探针，标记后再LIF检测需要测定分子量或氨基酸序列，可采用质谱检测多糖含量较高的多糖可以采用末端吸收法以紫外检测器检测含量较低的还原性多糖可用衍生试剂标记后以LIF、UV的方式检测51毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024第七章分离条件选择流程

分离条件的选择是毛细管电泳中最重要但也是最难之处。不同的专业研究工作者可能会有各自不同的选择策略和流程，我们提出如下九步选择流程，仅供参考：第一步，尽可能多地了解分离样品的类型、来源、组成及其性质；第二步，根据样品的可能性质和来源，选择分离模式，若无样品信息可先选CZE；52毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024条件选择流程

第三步，根据样品性质确定检测方法，一般先选直接紫外吸收；第四步，确定样品处理方式，包括衍生方案以及离心过滤除蛋白等；第五步，根据样品解离常数计算最佳pH，或利用75µmID毛细管和磷酸缓冲体系确定pH范围;53毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024条件选择流程

第六步，根据所需pH构建缓冲体系，包括进一步优化pH、缓冲试剂浓度等；第七步，优化其他操作参数，如毛细管尺寸、分离电压和温度等；第八步，确定是否需要使用添加剂和使用非水溶剂；第九步，确定是否需要换用其他分离模式。54毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024条件选择流程

在毛细管电泳条件选择中，还应充分注意下列操作事项：①最好对样品和缓冲液进行过滤或离心处理。②毛细管的洗涤或平衡，与缓冲体系、pH以及柱子有关。磷酸根与石英和玻璃之间存在慢相互作用，需要延长平衡或冲洗时间，处理的时间应由分离重现性决定。55毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024条件选择流程

③欲降低缓冲液的电导，应尽量使用所谓的“生物缓冲试剂”；欲降低检测背景，则应尽量使用无机缓冲试剂。④欲保持分离重现，要尽量采用相同的条件，包括毛细管、缓冲液、温度、电压、洗涤等。56毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024第八章各类物质的分离要点阴离子及有机酸此类物质没有紫外吸收，要采用间接检测法间接紫外法一般以铬酸钠等物质作为背景吸收物CTAB通常用作电渗流反向剂，以加速出峰，提高峰的尖锐度要使用反向极性分离57毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024各类物质的分离要点阳离子及金属离子的分离此类物质没有紫外吸收，要采用间接检测法间接紫外法一般以氨基吡啶等物质作为背景吸收物与阴离子不同的是阳离子的分析不需要在缓冲溶液中添加电渗流反向试剂也不需要使用反向极性分离58毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024各类物质的分离要点易电离有极性的化合物一般采用长60cm的毛细管分离的最佳pH在分析物pKa+/-1左右通常不需要添加剂59毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024各类物质的分离要点弱极性物质和水溶性差的物质（一些中药成分、农药等）要注意分析物的溶解性，防止在毛细管中的沉淀通过有机溶剂的添加，提高分析物在buffer中的溶解度添加SDS，增加溶解度降低样品中分析物的浓度，延长ramptime也可以防止分析物的析出60毛细管电泳原理及分析策略5/9/2024