乳制品中三聚氰胺的测定（乳制品检测）

三聚氰胺概述三聚氰胺事件一三聚氰胺的性质二三聚氰胺与假蛋白三一、三聚氰胺事件2007年，美国暴发了猫和狗肾衰竭的大规模疫情，原因是宠物食品中掺入了三聚氰胺。2008年9月，中国暴发三鹿婴幼儿奶粉受污染事件。《东方早报》记者简光洲发表《甘肃14名婴儿疑喝“三鹿”奶粉致肾病》，第一次点出三鹿奶粉的名字，引发巨大舆论跟进和问责风暴。2008年9月13日，卫生部证实，三鹿牌奶粉中含有的三聚氰胺，是不法分子为增加原奶或奶粉的蛋白含量人为加入的。三聚氰胺概述奶粉行业的911事件——2008年中国婴幼儿奶粉污染事件一、三聚氰胺事件2008年9月16日晚，质检总局通报全国婴幼儿奶粉三聚氰胺含量抽检结果，22家491批次婴幼儿奶粉检出三聚氰胺；除三鹿外，雅士利、伊利、蒙牛、圣元、熊猫、古城、光明等著名品牌也检出三聚氰胺，消息经中央电视台新闻联播报道后，三鹿奶粉事件正式升级为乳品行业的“三聚氰胺事件”，整个行业面临危机。2008年10月，国家卫生部等五部门公布乳与乳制品中三聚氰胺临时管理限量值，2011年4月，五部门联合发布公告，婴儿配方食品中三聚氰胺的限量值。三聚氰胺概述一、三聚氰胺事件该事件亦重创中国制造商品信誉，多个国家禁止了中国乳制品进口。2010年9月24日，中国国家质检总局表示，牛奶事件已得到控制，9月14日以后新生产的酸乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳等主要品种的液态奶样本的三聚氰胺抽样检测中均未检出三聚氰胺。2010年9月，中国多地政府下达最后通牒：若在2010年9月30日前上缴2008年的问题奶粉，不处罚。2011年中国中央电视台《每周质量报告》调查发现，仍有7成中国民众不敢买国产奶。三聚氰胺概述二、三聚氰胺的性质三聚氰胺概述三聚氰胺：别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺。分子式：C3N6H6、C3N3(NH2)3；分子量：126.12物理性能：白色结晶粉末，无毒，无味；相对密度：1570kg/m³；熔点：在常压下，354℃分解；升华温度：300℃；溶解性：能溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶；微溶于水、乙醇；不溶于乙醚、苯和四氯化碳，水溶液呈弱碱性二、三聚氰胺的性质三聚氰胺概述三聚氰胺是一种重要的氮杂环有机化工原料，显弱碱性，能够与各种酸反应生成三聚氰胺盐；三聚氰胺与醛类反应生成加成化合物；三聚氰胺与甲醛反应制成树脂，三聚氰胺树脂是一种多种用途的材料，防火耐热且有很高的稳定性，用于生产塑料、地板砖，厨房用具，防火纤维，商业滤膜，胶水和阻燃剂三、三聚氰胺与假蛋白三聚氰胺概述我们知道，食品工业中常常需要检查蛋白质含量，但是直接测量蛋白质含量技术上比较复杂，成本也比较高，不适合大范围推广，所以业界常常使用“凯氏定氮法”的方法，通过食品中氮原子的含量来间接推算蛋白质的含量。也就是说，食品中氮原子含量越高，这蛋白质含量就越高。这样一来，这名不见经传的三聚氰胺的由于其分子中含氮原子比较多，于是就派上大用场了……三、三聚氰胺与假蛋白三聚氰胺概述三聚氰胺的最大的特点是含氮量很高（66％），加之其生产工艺简单、成本很低，给了掺假、造假者极大地利益驱动，有人估算在植物蛋白粉和饲料中使“蛋白质”增加一个百分点，用三聚氰胺的花费只有真实蛋白原料的1/5。所以“增加”产品的表观蛋白质含量是添加三聚氰胺的主要原因，三聚氰胺作为一种白色结晶粉末，没有什么气味和味道，掺杂后不易被发现等也成了掺假、造假者心存侥幸的辅助原因。三聚氰胺试纸条快速测定原理一仪器和设备二结果判定四操作方法三注意事项五一、原理

三聚氰胺胶体金速测卡的检测原理是竞争性免疫层析。将着色标记物与待测抗原的特异性抗体(Ab1)相偶联,沉积在结合区。而检测区处固相化的是待测抗原或待测抗原的类似物。若样品中含有待测抗原,则样品中的抗原和带有标记物的Ab1形成Ag-Ab1复合物。随后在通过固相化有待测抗原或其类似物的检测区时,由于竞争抑制,不再发生反应,检测线处不显色;样品继续前移,Ag-Ab1复合物被固相化在质控线处的抗Ab1抗体(Ab2)所结合,形成Ab1-Ag-Ab2复合物,使质控线显色。高效液相色谱法二、仪器和设备三聚氰胺胶体金速测卡等高效液相色谱法三、操作方法高效液相色谱法1．将未开封的试纸卡和检测样品恢复至室温。2．将试纸卡水平放置，用滴管向试纸卡孔缓慢逐滴加入3滴不含气泡的待测液3．5分钟判断结果，10分钟后的结果仅作参考。四、结果判断高效液相色谱法阴性：C线显色，T线肉眼可见，无论颜色深浅均判为阴性。阳性：C线显色，T线不显色，判为阳性。无效：C线不显色，无论T线是否显色，该试纸均判为无效。图1结果显示图五、注意事项高效液相色谱法1．如果购买时发现过期，破损，污染，无效的产品，请在购买处进行更换。2．所有试纸启封后1小时内使用。高效液相色谱法

乳制品中三聚氰胺的测定原理一试剂和材料二分析步骤四仪器和设备三高效液相色谱测定五一、原理

试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法测定。高效液相色谱法二、试剂和材料除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。甲醇：色谱纯乙腈：色谱纯氨水：含量为25％～28％三氯乙酸柠檬酸辛烷磺酸钠：色谱纯甲醇水溶液：准确量取50mL甲醇和50mL水，混匀后备用。三氯乙酸溶液（1％）：准确称取10g三氯乙酸于1L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀后备用。高效液相色谱法二、试剂和材料高效液相色谱法氨化甲醇溶液（5％）：准确量取5mL氨水和95mL甲醇，混匀后备用。离子对试剂缓冲液：准确称取2.10g柠檬酸和2.16g辛烷磺酸钠，加入约980mL水溶解，调节PH至3.0后，定容至1L备用。三聚氰胺标品：CAS08-78-01，纯度大于99.0％三聚氰胺标准储备液：准确称取100mg（精确到0.1mg）三聚氰胺标准品与100ml容量瓶中，用甲醇水溶液溶解并定容至刻度配制成浓度为1mg/mL的标准储备液，于4℃避光保存。阳离子交换固相萃取柱：基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，填料质量为60mg，体积为3mL，或相当者。使用前依次用3mL甲醇、5mL水活化。定性滤纸海砂：化学纯，粒度0.65mm～0.85mm，二氧化硅（SiO2）含量为99％微孔滤纸：0.2微米，有机相氨气：纯度大于等于99.999％三、仪器和设备高效液相色谱（HPLC）仪：配有紫外线检测器或二极管阵列检测器分析天平：感量为0.0001g和0.01g离心机：转速不低于4000r/min超声波水域固相萃取装置氨气吹干仪涡旋混合器具塞塑料离心管：50mL研体高效液相色谱法四、分析步骤高效液相色谱法提取液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等

称取2g（精确至0.01g）试样于50mL具塞塑料离心管，加入15mL三氯乙酸溶液和5mL乙腈，超声提取10min,在震荡提取10min后，以不低于4000r/min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL滤液，加入5mL水混匀后做待净化液。四、分析步骤高效液相色谱法提取奶酪、奶油和巧克力等

称取2g（精确至0.01g）试样于研钵中，加入适量海砂（试样质量的4倍～6倍）研磨成干粉状，转移至50mL具塞塑料离心管中，用15mL三氯乙酸溶液分数次清洗研钵，清洗液转入离心管中，在往离心管中加入5mL乙腈，余下操作同液态奶提取“超声提取10min加入5mL水混匀后做待净化液”。

注：若样品中脂肪含量较高，可以利用三氯乙酸溶液饱和的正己烷液-液分配除脂后再用SPE柱净化。四、分析步骤高效液相色谱法净化

将提取液转移至固相萃取柱中。一次用3mL水和3mL甲醇洗涤，抽至近干后，用6mL氨化甲醇溶液洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1mL/min。洗脱液于50℃下用氨气吹干，残留物（相当于0.4g样品）用1mL流动相定容，涡旋混合1min，过微孔滤膜后，供HPLC测定。五、高效液相色谱测定高效液相色谱法HPLC参考条件色谱柱：C8柱，250×4.6[内径（i.d.）]，5μm或相当者。C18柱，250×4.6[内径（i.d.）]，5μm或相当者。流动相：C8柱，离子对试剂缓冲液-乙腈（85+15，体积比），混合。C18柱，离子对试剂缓冲液-乙腈（90+10，体积比），混合。流速：1.0mL/min柱温：40℃波长：240nm进样量:20μL五、高效液相色谱测定高效液相色谱法标准曲线的绘制用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为0.8、2、20、40、80μg/ml的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。基质匹配加标三聚氰胺的样品HPLC色谱图参见图A.1五、高效液相色谱测定高效液相色谱法定量测定待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。结果计算试样中三聚氰胺的含量由色谱数据处理软件或按式（1）计算获得：

X

试样中三聚氰胺的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）A

样液中三聚氰胺的峰面积C

标准溶液中三聚氰胺的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）V

样液最准定容体积，单位为