结核病疫苗的新进展

全国结核病学术会议

结核病疫苗的新进展5/9/20241结核病疫苗的新进展国际公共卫生问题

20世纪的中期，许多从事卫生事业的专业人员曾经很乐观地认为传染病将在不久的将来被彻底消灭。如今，艾滋病的流行、肺结核、疟疾、以及各种具有抵抗抗生素的传染病每年使上百万的人死亡。在很大程度上，不仅因为缺乏科学知识使这些流行病得以传播，而且承受传染病压力最大的贫穷国家没有对付这些疾病的工具。5/9/20242结核病疫苗的新进展5/9/20243结核病疫苗的新进展结核病问题的严重性全世界约1/3的人口（近20亿）携带结核菌。每年有2000万人患活动性结核病。每年约有300万人死于结核病。结核病每15秒钟就杀死1人。预计未来20年还将有3600万人死于结核病。5/9/20244结核病疫苗的新进展结核病卷土重来的主要原因BCG免疫效果的降低耐多药结核分枝杆菌(multi-drugresistantTB,MDRTB)的播散HIV与TB的双重感染人口大规模的流动5/9/20245结核病疫苗的新进展中国结核病状况

中国是WHO确定的MDRTB的高发病率的热点地区。结核病人数居全世界第二位，是世界第二大结核病重灾区。中国是全球22个结核病高负担国家之一。全国结核杆菌感染人数5亿。现有结核病人600万，每年新发病例113万，每年死亡人数25万。5/9/20246结核病疫苗的新进展国家卫生部近期报告发病数居前五位的病种为：乙型肝炎、肺结核、淋病、痢疾、未分型病毒性肝炎。死亡数居前五位的病种为：狂犬病、肺结核、乙型肝炎、流脑、新生儿破伤风。5/9/20247结核病疫苗的新进展怎么办？在世界面临的严重的结核病防治问题上，我们应当做什么？1、研究结核杆菌致病机制2、发现抗结核病新药3、研制抗结核病疫苗5/9/20248结核病疫苗的新进展CD4+Th1或Th2T淋巴细胞与抗结核免疫反应的关系5/9/20249结核病疫苗的新进展CD4＋、CD8＋T细胞在清除胞内感染结核杆菌中的不同途径与效果引自SilvaCL,FEMSMicrobiologyLetters,2001;197:11CD4+CD8+5/9/202410结核病疫苗的新进展结核病疫苗的新进展

(一)减毒疫苗(二)重组疫苗(三)亚单位疫苗(四)DNA疫苗(五)治疗性疫苗5/9/202411结核病疫苗的新进展OrmeIM.2001美国NIH结核疫苗研究项目概况5/9/202412结核病疫苗的新进展

1.牛型分枝杆菌减毒活疫苗BCG。2.田鼠分枝杆菌减毒活疫苗。自然突变株，保护力和BCG相当。已应用于临床实验。3.通过基因敲除/突变人型结核杆菌毒力基因，构建结核杆菌减毒活疫苗。

（一）减毒活疫苗5/9/202413结核病疫苗的新进展1.减毒活疫苗BCG

近80年历史的减毒活疫苗BCG是目前仅有的预防结核病的疫苗。BCG来源于传代230代的牛分枝杆菌，一直被广泛用作预防结核病的疫苗，但多年的应用发现BCG的两大特性:1、极不稳定，地域性极强，保护效果从高达80%至某些地域的0%，有时甚至带来有害效果;2、BCG通常可有效保护新生儿及儿童免患初期疾病如结核性脑膜炎，而对青少年及成人几乎不能提供阻止后期感染性肺结核发生的保护力。BCG似为一双刃剑，有时保护，而有时毫无用处甚至有害。因此，BCG的免疫病理和毒力问题仍待谨慎的研究和探讨。5/9/202414结核病疫苗的新进展卡介苗免疫保护效果5/9/202415结核病疫苗的新进展

BCG保护作用差异大的原因BCG丢失了一些结核杆菌特异性抗原；环境分枝杆菌的作用，使BCG在体内受到抑制，不能引起有效的免疫保护作用；BCG株、剂量和接种方案存在差异；人群基因差异；结核杆菌基因差异。5/9/202416结核病疫苗的新进展BCG所缺失的结核杆菌特异性基因组区域引自MustafaAS.MolecularImmunology,2002;39:1135/9/202417结核病疫苗的新进展环境分枝杆菌感染使BCG失去免疫保护作用引自AggerEM.Vaccine,2002;21:75/9/202418结核病疫苗的新进展(二)重组疫苗优良的佐剂和安全的载体表达多个抗原表位诱导持续的免疫记忆和高水平的细胞免疫综合各疫苗优势5/9/202419结核病疫苗的新进展2.1重组BCG疫苗安全的载体：以BCG为表达载体。人型结核杆菌保护性抗原：Ag85B和ESAT-6，MPT64等。增强细胞免疫反应的细胞因子：IFN-r,IL-2,IL-12,G-CSF等。5/9/202420结核病疫苗的新进展构建重组BCG疫苗示意图5/9/202421结核病疫苗的新进展Ⅰ重组MtbRD1-2F9（含ESAT-6基因）BCG疫苗免疫保护力增强-体重变化重组BCG免疫保护力比较salineBCGBCG:RD1-2F95/9/202422结核病疫苗的新进展重组MtbRD1-2F9BCG疫苗免疫保护活性增强—细菌清除率改变salineBCGBCG:RD1-2F9salineBCGBCG:RD1-2F95/9/202423结核病疫苗的新进展重组MtbRD1-2F9BCG疫苗免疫保护活性增强—脾脏组织观察引自PymAS.NatureMedicine,2003;9:5335/9/202424结核病疫苗的新进展Ⅱ重组MtbAg85BBCG疫苗(rBCG30)免疫活性增强—DTH反应增强引自HorwitzMA.PNAS,2000;97(25):138535/9/202425结核病疫苗的新进展rBCG30免疫保护性增强—体重变化5/9/202426结核病疫苗的新进展rBCG30免疫保护性增强—肺脏和肝脏组织学观察5/9/202427结核病疫苗的新进展2.2重组痘苗病毒疫苗痘苗病毒疫苗也是一安全的载体。将结核杆菌抗原Ag85和组织纤维蛋白溶酶原激活因子（tPA)信号肽基因拼接后，导入痘苗病毒载体，形成重组痘苗疫苗，可以高效表达Ag85。用该疫苗免疫小鼠，可以刺激针对结核菌的保护性免疫反应（IL-2、IFN-γ升高）。5/9/202428结核病疫苗的新进展表达MtbAg85复合体的痘苗病毒免疫反应引自MalinAS.MicrobesandInfection.2000;2:16775/9/202429结核病疫苗的新进展表达MtbAg85复合体的痘苗病毒免疫反应5/9/202430结核病疫苗的新进展2.3重组沙门氏菌疫苗

以鼠伤寒杆菌（Salmonellatyphimurium)为载体，导入融合的结核杆菌Ag85B基因和HlyB基因（转运Ag85B蛋白出胞外），可得到能够分泌表达Ag85B融合蛋白的重组活疫苗。口服该疫苗免疫小鼠，明显增高了IFN-γ和TNF-α的生成，并且在一定时期内具有和BCG相当的免疫保护能力。5/9/202431结核病疫苗的新进展重组MtbAg85B鼠伤寒杆菌疫苗免疫反应性观察—细胞因子变化引自FEMSImmunologyandMedicalMicrobiology2000,27:283-2685/9/202432结核病疫苗的新进展重组MtbAg85B鼠伤寒杆菌疫苗免疫效应观察—保护力比较5/9/202433结核病疫苗的新进展2.4重组BCG多价疫苗5/9/202434结核病疫苗的新进展国内在重组BCG方面的研究1、复旦大学王洪海：IFN-γ+Ag85B+ESAT-62、第四军医大学徐志凯：IL-2+Ag85B+ESAT-63、四川大学华西医学院鲍朗：ESAT-6Infect.Immun.2003,71(4):16564、华中理工大学同济医学院皇甫永穆：HSP65JHuazhongUnivSciTechnologMedSci.2004;24(2)

5/9/202435结核病疫苗的新进展表达载体的构建

HYGHYGpOLYGrIFNAg85boriMoriMMCSMCS连接酶切BCGPPPESAT5/9/202436结核病疫苗的新进展

融合基因在E.coli中的表达(1)携带人IFN-γ--Ag85B融合基因在原核细胞中的表达(2)携带人IFN-γ--ESAT-6融合基因在原核细胞中的表达(3)携带人IFN-γ--Ag85B--ESAT-6融合基因的原核表达5/9/202437结核病疫苗的新进展（三）亚单位疫苗结核杆菌培养基滤过蛋白（CFP）一定程度上具有保护小鼠感染结核的能力，这促使人们开始研究有效的亚单位疫苗。人们在早期培养滤液中发现具有明显免疫原性的蛋白质：Ag85复合体和ESAT-6。二者分别具有免疫保护作用，当二者融合表达则时保护力更强，可达到和BCG相当的水平。克隆分泌蛋白Mtb8.4,并通过与T细胞相互作用分析发现它可被T细胞识别，免疫动物证明它具有很强的免疫活性。5/9/202438结核病疫苗的新进展30kD分泌蛋白(Ag85)的免疫原性——T细胞增殖反应引自SinhaRK.Vaccine,1997;15:6895/9/202439结核病疫苗的新进展亚单位疫苗的特点环境分枝杆菌存在使BCG的预防保护作用大为降低，此时亚单位疫苗具有较好的免疫保护力。免疫佐剂和细胞因子对疫苗的效应影响很大。T细胞表位对于亚单位疫苗非常关键。疫苗通过特异性表位和特异性的T细胞作用，分别激活Th1和CTL。可以作为治疗性疫苗。5/9/202440结核病疫苗的新进展5/9/202441结核病疫苗的新进展引自MustafaAS.MolecularImmunology,2002;39:113T细胞表位5/9/202442结核病疫苗的新进展利用后基因组学寻找亚单位疫苗5/9/202443结核病疫苗的新进展

（四）DNA疫苗

基因免疫(Geneticimmunization)，又称遗传免疫，或者叫做DNA疫苗(DNAVaccine)，是九十年代发展起来的一种崭新的免疫接种技术。是继巴斯德开创的减毒疫苗，基因工程疫苗之后的第三代疫苗。基因免疫的主要原理是将抗原编码基因插入带有强启动子的质粒载体，然后用物理方法将此重组质粒导入体内细胞，抗原编码基因即在细胞内表达合成抗原蛋白，诱发机体产生保护性免疫反应。5/9/202444结核病疫苗的新进展1.DNA疫苗作用机制示意图5/9/202445结核病疫苗的新进展

2.DNA疫苗操作方法

DNA疫苗的组成：一般由病原体抗原编码基因和作为真核表达载体的质粒构成。编码基因：①完整的一组基因；②单个基因的cDNA；③抗原决定簇的一段基因。总之表达产物为病原体有效抗原成分。5/9/202446结核病疫苗的新进展3．影响基因转染和表达的因素

(1)年龄对DNA表达的影响（2）性别对DNA表达的影响（3）DNA剂量及保存液对表达的影响（4）表达载体的选择（5）不同组织细胞对DNA表达的影响（6）接种途径5/9/202447结核病疫苗的新进展4.DNA疫苗的优点

（1）直接转入DNA，包括开放读框，适当的真核转录和翻译调控因子，可以体内合成蛋白质，其折叠和翻译后修饰在大多数情况下和普通感染类似，模拟病毒感染的体内蛋白质合成进入MHC－I途径，也可以由APC识别进入MHC－II途径，这样细胞免疫和体液免疫反应都调动起来，可诱发持久的免疫应答。（2）由于转入DNA本身缺乏复制机制，不会与宿主染色体基因整合，所以不会象减毒疫苗出现毒力恢复的可能性。5/9/202448结核病疫苗的新进展DNA疫苗的优点（3）构建DNA疫苗载体相对容易，而成熟的质粒DNA纯化技术能够加快和简化发展新疫苗的进展，并可提供广谱的疫苗。（4）DNA疫苗的制备成本低于基因工程重组疫苗，可以免去生产和纯化蛋白质的大量费用，制备起来省时省力。5/9/202449结核病疫苗的新进展5.DNA疫苗的新进展

Krieg发现细菌DNA能够诱导非特异性的免疫反应，而脊椎动物的DNA却不能。研究发现在这两个基因组内主要是未甲基化胞嘧啶－磷酸－鸟嘌呤（unmethylatedcytosine-phosphate-guanine,CpG－免疫刺激序列）二核苷出现的频率不同。

5/9/202450结核病疫苗的新进展5/9/202451结核病疫苗的新进展5/9/202452结核病疫苗的新进展Ag85复合体DNA疫苗的免疫反应性引自LozesE,Vaccine,1997;15:830(下同）5/9/202453结核病疫苗的新进展Ag85免疫保护性5/9/202454结核病疫苗的新进展5/9/202455结核病疫苗的新进展提高DNA疫苗效果的方法使用免疫佐剂细胞因子应用DNA疫苗联合使用DNA疫苗和亚单位疫苗、BCG等结合使用5/9/202456结核病疫苗的新进展HSP65DNA疫苗/TDM(trehalosedimicolate)微球体增强免疫效果——Ⅰ抗体滴度变化引自LinaKM,Genetherapy,2003;10:678（下同）5/9/202457结核病疫苗的新进展肺细胞再次受Mtb攻击时，IFN-γ分泌差异HSP65DNA疫苗/TDM微球体辅助增强免疫效果——Ⅱ细胞因子变化5/9/202458结核病疫苗的新进展细胞因子促进疫苗保护作用

—IL-12和IL-18对Ag85BDNA疫苗保护力的影响引自TriccasJA.ImmunologyandCellBiology,2002;80:3465/9/202459结核病疫苗的新进展细胞因子GM-CSF和IL-12,15,18对HSP65DNA疫苗的免疫增强作用引自BaekKM.Vaccine,2003;21:3684（下同）5/9/202460结核病疫苗的新进展细胞因子GM-CSF和IL-12增强HSP65的免疫保护作用5/9/202461结核病疫苗的新进展DNA疫苗联合使用提高保护效果5/9/202462结核病疫苗的新进展DNA—亚单位疫苗联合使用增强免疫效果HSP65DNA疫苗免疫动物（牛）后，再用重组HSP65蛋白来增强免疫效果引自VordermeierHM.VeterinaryMicrobiology,2003;93:3495/9/202463结核病疫苗的新进展DNA疫苗-BCG联合使用策略预先用Ag85DNA疫苗免疫小鼠，可以增强BCG的保护效果引自BrittonWJ.ImmunologyandCellBiology,2003;81:345/9/202464结核病疫苗的新进展国内在DNA疫苗方面的研究1、北京309医院吴雪琼等：（１）MPT64DNA疫苗（军医进修学院学报,2001）（２）Ag85ADNA疫苗（中国免疫学杂志,2002）2、山东省医科院田志刚等：Ag85BDNA疫苗（中国免疫学杂志,2001）3、重庆医科大学朱道银等：Ag85B-MPT64融合基因疫苗（中华结核和呼吸杂志，2003）4、第二军医大学孙树汉等：ESAT-6DNA疫苗（Vaccine,2004）5、华西医科大学鲍朗等：Ag85ADNA疫苗（免疫学杂志2003）5/9/202465结核病疫苗的新进展（五）结核病的治疗性疫苗

结核病的问题在有了卡介苗(BCG)和特效抗生素以后曾被长期忽视，现在随着AIDS的全球侵袭而卷土重来，再次成为疾病和死亡的首要原因之一。世界卫生组织已宣布结核为"全球性急症"，但其年感染率仍在攀升。缺乏一种适用于所有地区的高效预防性疫苗是结核失控的原因之一，而更关键的原因在于缺乏适用于大量已感染结核杆菌的结核患者的治疗性疫苗及药物，使患者由初期感染发展为可传播的结核性疾病。5/9/202466结核病疫苗的新进展研究治疗性疫苗的必要性

由于抗菌药物滥用，产生严重危害，出现结核杆菌的耐药性。目前，全球已有17亿人感染了结核杆菌，约有2千万结核病人。现在每年新增加病例800万，死于结核病的达300人，高居传染病死亡人数之首。HIV/M.tb的双重感染使得重大传染病的防治雪上加霜。因此需要开发新的药物和治疗性疫苗。5/9/202467结核病疫苗的新进展结核治疗性疫苗的试验1、热灭活分枝杆菌疫苗免疫或联合激素药物的治疗性试验2、多肽疫苗的治疗性试验3、基因疫苗的治疗性研究4、其他形式的结核治疗性疫苗5/9/202468结核病疫苗的新进展5.1热灭活分枝杆菌＋激素药物

肺结核在BALB/c小鼠模型中的建立促进了结核治疗性疫苗的试验研究。Hernandez-Pando等以结核杆菌H37Rv经气管感染BALB/c小鼠，初期出现以分泌Th1细胞因子、TNF-a和IL-1为特征的抗感染症状，60天左右时则发展为TNF-a和IL-1消失、IL-4分泌增高的进行性肺炎症状，此时及90天时，给予热灭活分枝杆菌疫苗2次免疫或联合一激素药物17-B-雄烯二醇(AED)注射，结果该疫苗可使小鼠重新表达Th1细胞因子TNF-a和IL-la，并使肺炎转化为肉芽肿，达到与AED相似的效果，但二者无协同作用。

5/9/202469结核病疫苗的新进展5.2多肽疫苗的治疗试验利用多肽疫苗激活细胞免疫，尤其是CD8+CTL的活性，有助于结核杆菌的彻底清除。0lsen等在该BALB/c小鼠肺炎模型中测试了多肽疫苗的治疗效果。将来自结核杆菌培养物早期分泌性蛋白质中的相对分子质量6x103(ESAT-6)的两种多肽1-20和51-70以dimenthyl

dioctadecylam-moniumbromide/单磷酰脂A/IL-2混合物乳化后免疫经血管或气雾剂致肺炎的小鼠，发现ESAT-6的51～70多肽疫苗可诱生细胞免疫应答，免疫保护小鼠，其效果近于ESAT-6蛋白辅以BCG的免疫效果。5/9/202470结核病疫苗的新进展5.3DNA疫苗的治疗性研究

DNA疫苗是发展治疗性结核疫苗的极具吸引力的一项新技术，许多研究已显示DNA疫苗具强有力的保护作用。Morris等以结核菌MPT-63和MPT-83抗原构建的DNA疫苗，可提供小鼠对Erdman结核杆菌的免疫保护力;而多价ESAT-6、MPT-64、MPT-63和KatGDNA疫苗联合免疫可诱生分别针对4种结核抗原的体液和细胞免疫应答，而且可达到BCG活疫苗的保护效果。5/9/202471结核病疫苗的新进展

DNA疫苗的治疗效果

1999年的《自然》杂志载文介绍，感染了结核病的小鼠在接受结核DNA疫苗注射后，其体内原本软弱无效的免疫反应会大大加强，并会通过有效刺激T细胞而获得杀灭结核杆菌的能力。这项研究还发现，DNA疫苗可消灭某些具有抗药性的结核杆菌。5/9/202472结核病疫苗的新进展HSP65DNA疫苗治疗结核潜伏感染5/9/202473结核病疫苗的新进展引自LovvieDB.Nature,1999;400:269HSP65DNA疫苗治疗结核潜伏感染5/9/202474结核病疫苗的新进展Ag85ADNA疫苗结合化学疗法治疗结核潜伏感染引自HaSJ.GeneTherapy,2003;10:15925/9/202475结核病疫苗的新进展Ag85ADNA疫苗结合化学疗法治疗结核潜伏感染—治疗效果观察M.tb.H37Rvc.f.u.(log10)5/9/202476结核病疫苗的新进展5.4其他形式的结核治疗性疫苗

重组疫苗