青蒿素分析方法的确定

青蒿素分析方法的确定青蒿青篙为菊科一年生草本植物黄花篙干燥地上部分，性寒，味苦、辛，归肝胆经，可清热解暑、除蒸、截疟，主要分布于重庆、四川、云南、广西等地。目前青篙素系列药物已取代奎宁成为治疗疟疾的最安全有效的药物。青蒿素是青蒿抗疟的有效成分，也是合成青蒿素系列药物的起始原料，它的需求量很大。第2页,共45页，2024年2月25日，星期天为什么要测定青蒿素的含量不同产地的青蒿药材中青篙素的含量差异较大，而青蒿素是青篙截疟的主要有效成分，因此对药材中青篙素含量的准确测定十分必要。提取青蒿素的溶剂：青蒿素C15H22O5在丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷或苯中易溶,在甲醇、乙醇、稀乙醇、乙醚及石油醚中溶解,在水中几乎不溶解;在冰醋酸中易溶。第3页,共45页，2024年2月25日，星期天青蒿素的有效成分

青蒿素是从黄花蒿中提取分离得到的含过氧基团的新型半萜内酯。其多种衍生物均是治疗疟疾的有效单体，国内外公认的首创新药。将青蒿素结构中的C-10为羰基还原成羟基得双氢青蒿素，进一步烷基氧化得蒿甲醚，而进行酯化可得到青蒿琥酯。青蒿素artemisinin第4页,共45页，2024年2月25日，星期天双氢青蒿素为天然抗疟药青篙素经钠硼氢还原而产生的半缩醛化合物,其12位的羟基具有差向异构,差向异构体a与β在一定溶剂中有相互转化并达到平衡的过程。DHA分子结构中无共扼结构和发色基团,不宜用分光光度法或HPLC法测定含量。双氢青蒿素dihydroartemisinin双氢青蒿素第5页,共45页，2024年2月25日，星期天定性分析定量分析紫外分光光度法IR、MS、NMRHPLC(UV、ELSD、SPD...)UPLCLC-MS/LC-MS-MS高效毛细管电泳CETLC第6页,共45页，2024年2月25日，星期天1.1青蒿素的IR定性分析双氢青蒿素dihydroartemisinin第7页,共45页，2024年2月25日，星期天3376O-H;1227C-O;1025C-O-C;2925-CH3;总结：IR专属性强，一般做标准谱图对照法第8页,共45页，2024年2月25日，星期天1.2紫外分光光度法原理：1.由于青蒿素药物分子结构中母核不具有共轭体系，其紫外吸收光谱的主要是末端吸收。但C-10位由于取代基不同具有一定的吸收特征。2.青蒿素由于具有过氧桥和缩醛结构,对酸碱不稳定,对强碱极不稳定,热至熔点以上即迅速分解。采用0.2%氢氧化钠50℃水浴加热30min进行水解,水解后的波长扫描结果显示青蒿素在紫外区有最大吸收峰Kmax=290.5nm,由此确定最适波长为292nm。（青蒿素衍生化，酸化后亦可作HPLC-UV检测）第9页,共45页，2024年2月25日，星期天1.青蒿素标准品0.1g+95%稀释成0.001%的标准品溶液第10页,共45页，2024年2月25日，星期天2.0.001%标准溶液0.5ml加入95%乙醇4.5ml,再加入0.2%NaOH20ml定容至25ml,50℃水浴加热30min,取出快速冷却。第11页,共45页，2024年2月25日，星期天3.分别取0.5、1.0、2.0ml的.001%青蒿素标准溶液,分别加入95%乙醇4.5、4.0、3.0ml,再各加入0.2%NaOH20ml定容至25ml,配成浓度分别为2×10-5%、4×10-5%、8×10-5%的标准溶液,50℃水浴加热30min,取出快速冷却,在已经确立的最适波长下分别测吸光度。第12页,共45页，2024年2月25日，星期天4.样液的制备取青蒿待测样品研细粉末0.5g,加入95%乙醇10ml浸泡,50℃水浴加热60min进行提取,取出样品振摇、冷却、过滤,取滤液1ml,加入95%乙醇14ml,再加入0.2%NaOH10ml,配制成青蒿素样品溶液,50℃水浴加热30min。在已经确立的最适波长下分别测吸光度,对浓度作图,建立标准曲线。第13页,共45页，2024年2月25日，星期天∴青蒿素含量=(青蒿素样品浓度×标准浓度单位×原始体积)/青蒿研细粉末质量朗伯比尔定律：A=-lgT=εbcb，ε一定，吸光度A和溶液浓度c成正比第14页,共45页，2024年2月25日，星期天UV法总结UV法测定青蒿素是依据青蒿素在碱性条件下生成的青蒿素衍生物Q292在292nm波长处有较强的紫外吸收来定量的，其优点是操作简单，对仪器设备的要求不高，其缺点是不能排除青蒿素类似物等物质的干扰。因此，UV法测定青蒿中青蒿素的含量实际反映的是药材中青蒿素及其类似物的总量。陈靖等[5]报道，青蒿中青蒿素类似物青蒿酸、青蒿素B、3α-羟基-1-去氧青蒿素的平均含量分别为0.47％、0.05％、0.005％，对青蒿中青蒿素含量的测定影响较大，使得测定结果偏高。第15页,共45页，2024年2月25日，星期天1.3HPLC法常见检测器:1.UV2.DAD（二极管阵列检测器）3.FD（荧光检测器）4.RID(示差折光率检测器)5.ECD(电化学检测器)6.ELSD（蒸发光散射器检测器）原理：利用流动相与组分间的亲和力，通过组分、流动相和固定相三者间的相互作用来实现分离。第16页,共45页，2024年2月25日，星期天文献报道同时测定青蒿中青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸的方法有HPLC-UV-ECD法（高效液相色谱紫外电化学检测法）、HPLC-MS/MS法,采用ELSD法（蒸发光散射检测法）检测仅有很弱紫外吸收的青蒿素、UV法检测青蒿中含量较低的青蒿乙素和青蒿酸。第17页,共45页，2024年2月25日，星期天蒸发光散射检测器(ELSD)为通用型的质量检测器,对结构相似物质可给出几乎相同的响应因子,响应值大小取决于物质浓度及检测条件下物质颗粒的大小,而不依赖于紫外吸收,因此适合于青蒿素及双氢青蒿素的含量测定。1.3.1HPLC-ELSD法第18页,共45页，2024年2月25日，星期天第19页,共45页，2024年2月25日，星期天SPD(二极管阵列检测器)与ELSD同时检测,发现双氢青蒿素转化平衡后SPD图中。a异构体与β异构体峰面积之比为4:1,而ELSD检测得。a异构体与β异构体峰面积之比为8:1。因为ELSD对结构相似物质能给出几乎一致的响应因子,属于质量响应型检测器,因此得到的峰面积比即为转化平衡后a异构体与β异构体的实际物质量比。从而也可得知a与β异构体对UV的响应因子不同,如用UV检测则不能直接采用二者峰面积之和定量。例：HPLC-ELSD法测定复方双氢青篙素片中双氢青篙素的含量第20页,共45页，2024年2月25日，星期天第21页,共45页，2024年2月25日，星期天2.对照品溶液:取复方双氢青篙素片10片,剥去薄膜衣,精密称定,研细,精密称取适量,置25mL量瓶中,加乙睛适量,40℃超声处理5min。放冷至室温,定容。摇匀,滤过,取续滤液2mL加水稀释至10mL。例：复方双氢青篙素片（含双氢青篙素32mg,磷酸呱哇0.32g,甲氧苄啶90mg)中青蒿素含量的测定1.对照品溶液:精密称取DHA对照品适量,置50mL量瓶中,加乙睛适量,40℃超声处理5min。放冷至室温,定容,即得1.28mg/mL的对照品储备液。再精密量取此储备液适量,用水稀释制成256mg/mL的对照品溶液。第22页,共45页，2024年2月25日，星期天ELSD检测器检测时少量溶解的甲氧苄啶峰及a异构体峰与β异构体峰均能达到完全分离,三者的分离度分别为2、8和4,a异构体与β异构体保留时间分别约为5.7min和7min,理论板数按a异构体或β异构体峰计均不低于6000。SPD扫描图谱显示最先流出的成分为甲氧苄啶,与后面的a异构体及β异构体完全分离,不影响测定。第23页,共45页，2024年2月25日，星期天1.3.2HPLC-UV-ELSD同时测定青蒿中青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸的方法青蒿素只有很弱的末端紫外吸收,一般不用UV法进行精确定量分析,故选择用ELSD法检测。用ELSD法也可检测青蒿乙素和青蒿酸,但由于其灵敏度低,对这两个成分含量低的青蒿药材来说,该法同时测定3种成分较困难,故采用灵敏度较高的UV法对青蒿乙素和青蒿酸进行定量测定。UV检测器对所测成分性质无任何影响,据此可使用HPLC-UV-ELSD同时测定青蒿中3种成分。第24页,共45页，2024年2月25日，星期天色谱分析条件色谱柱:NucleodurC18(250mm×416mm,5μmD);流动相:乙腈-0.1%乙酸(50∶50);流速:110mL/min;柱温:25℃青蒿乙素和青蒿酸用UV检测器检测,波长为209nm;青蒿素用ELSD检测器检测,漂移管温度50℃,载气(N2)压力30psi(1psi≈619kPa),增益值为50;进样体积为10或30μL。第25页,共45页，2024年2月25日，星期天HPLCchromatogramsofreference(A,B)andtheextractfromHerbaArtemisiaeAnnuae(C,D).A,C:UV；B,D:ELSD;1:ArteannuinB;2:Artemisinin;3:Artemisinicacid第26页,共45页，2024年2月25日，星期天1.2.2RP-HPLC1.常规的液相方法将青蒿素进行柱前衍生,将其与碱反应后,产生一化合物(Q292),该物质在292nm处有最大吸收,然而,由于反应后有无机碱存在,易损坏色谱柱,不适宜直接进样测定。但化合物Q292在pH值5.58~6.04条件下,又可定量地转化为化合物Q260,该物质在260nm处有最大吸收,可用于做HPLC测定[12]。2.又∵青蒿素在203nm处有弱吸收峰的性质，HPLC法在203nm直接测定,大多采用甲醇作溶剂稀释对照品,使其在紫外区203nm处有极弱的吸收,其灵敏度及重复性均较差,(选用丙酮作溶剂,在203nm处有较强的吸收[11])。第27页,共45页，2024年2月25日，星期天1.衍生化法[13]：色谱条件：色谱柱:LichrospherC18(4.6mm×250mm,5Lm);流动相:甲醇-缓冲液(体积比50：50;0.01mol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液);流速:0.8mL/min;柱温:30e;灵敏度:2.000AUFS;检测波长:260nm;进样量:20μL。第28页,共45页，2024年2月25日，星期天2.末端吸收[14]色谱条件：色谱柱KromasilODSC18(416mm×250mm,5μm);流动相为乙腈-水(60：40);流速为1.0mL/min;检测波长为203nm;柱温30℃。理论塔板数2000.第29页,共45页，2024年2月25日，星期天1.2.4LC-MS-MS体内药物分析是测定体液(主要是血浆、血清或全血)中药物或其他代谢物浓度。由于血液样品试样提供量少，基质复杂，在此混合物中分析某种微量成分(通常为(g/mL或ng/mL水平)并加以鉴别，常常是对分析化学家的挑战。药物的是用来预防、诊断及治疗疾病的一类特殊物质，与人们的健康和生命安危有极其密切的关系，杂质检查及其限度控制是保证药品质量的一个重要方面。使用LC-MS／MS可以简便地对药物中杂质加以监控.LC-MS虽然有足够的灵敏度，但遇到LC难以分离的组分，其应用受到限制。使用LC-MS／MS可以克服背景干扰，通过MS／MS的选择反应控制模式(SRM)或多反应检测模式(SRM)，提高信噪比，因此对复杂样品仍可达到很高的灵敏度。第30页,共45页，2024年2月25日，星期天分析条件色谱条件色谱柱为RESTEKPinnacleC18柱(150mm×2.1mm,5μm);流动相为甲醇-水-10mmol/L乙酸胺(80:10:10);流速200μl/min;柱温:室温。质谱条件电喷雾ESI源;喷雾电压IS为4000V;雾化温度400℃;雾化气NEB(GAS1)为12L·min-1;加热辅助气AUX(GAS2)为7L/min;帘气CUR为6L·min-1;碰撞气CAD3L·min-1;检测方式为正离子多离子反应监测(MRM),用于定量分析的离子分别为m/z302.3→m/z163.3(DHA)和m/z300.2→m/z209.3(内标ART)高液相色谱-质谱联用法测定人血浆双氢青蒿素浓度[24]第31页,共45页，2024年2月25日，星期天在选定的检测条件下,DHA和内标ART生成的基峰离子为其加NH4+离子[M+NH3]+,将其基峰离子作为母离子进行产物离子扫描分析,得到二者的全扫描及子离子扫描图。第32页,共45页，2024年2月25日，星期天根据DHA离子扫描图,在选定的检测条件下,离子对mPz302.3→m/z267.1响应明显高于m/z302.3→mPz163.3,但该离子对的测定易受到血浆内源性物质的轻度干扰,为定量准确,选择离子对m/z302.3→m/z163.3用于定量分析,不受基质效应的影响。第33页,共45页，2024年2月25日，星期天LC-MS/MS测定血浆双氢青蒿素(DHA)的色谱图A:空白血浆第34页,共45页，2024年2月25日，星期天B:空白血浆加DHA(3.03ng·ml-1)和内标1:DHA双氢青蒿素;2:内标ART青蒿素第35页,共45页，2024年2月25日，星期天C:受试者药后血浆样品加内标第36页,共45页，2024年2月25日，星期天1.3.5UPLC与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度都比HPLC要高。例：UPLC-UV测定青蒿素的含量[26]色谱条件：色谱柱:AgilentEclipsePlusC18(2.1mm×50mm，1.8μm);流动相:乙腈－水(45∶55);流速:1.0mL/min;柱温:28℃;检测波长:200nm;进样体积:1μL。第37页,共45页，2024年2月25日，星期天第38页,共45页，2024年2月25日，星期天1.4毛细管电泳毛细管电泳法(CE)具有高效、快速、样品用量小、耗费少等优点,已被广泛用于药物分析。CE电化学检测具有装置简便易行、价廉、检测灵敏度较高的优点，它的性能在分离许多生化物质上要优于一般的色谱法。带电粒子与aq中电荷结合带电水解带电E定向运动电渗流第39页,共45页，2024年2月25日，星期天CE工作原理3-毛细管4-检测器第40页,共45页，2024年2月25日，星期天分离条件：分离介质4.0mmol/L三乙胺-2.0mmol/LH3BO3-15.0%C2H5OH,分离电压22.0kV,20.0cm位差虹吸进样15.0s。在该实验条件下,可在5min内实现对双氢青蒿素的分离检测,双氢青蒿素的峰面积与含量在3.0～165μg/mL范围线性关系良好,检出限为1.0μg/mL。例：复方双氢青蒿素片中双氢青蒿素的测定[28]∵复方制剂中的其他成分在该条件下并不出峰,故不干扰测定,可能是在优化条件下难以电离的缘故∴采用毛细管电泳非接触高频电导法对双氢青蒿素进行了快速分析。第41页,共45页，2024