第二章 DNA重组克隆的单元操作课件

第二章

DNA重组克隆的单元操作2014年2月第二章-DNA重组克隆的单元操作本章节内容DNA重组的载体(装载DNA的工具）DNA的体外重组（切、连）重组DNA分子的转化与扩增（转、增）转化子的筛选与重组子的鉴定（检测）目的基因的克隆（供体中的目标DNA的克隆）第二章-DNA重组克隆的单元操作第一节DNA重组的载体质粒载体λ双链噬菌体DNA载体M13单链噬菌体DNA载体噬菌体-质粒杂合载体第二章-DNA重组克隆的单元操作载体的功能为外源基因提供进入受体细胞的转移能力为外源基因提供在受体细胞中的复制、扩增或整合能力（指DNA拷贝数的增加）（所有载体必须具备的能力）为外源基因提供在受体细胞中的表达能力（指基因的表达，使外源基因通过mRNA和蛋白质在受体细胞中发挥功能，进而可发现基因在生物体内发挥的作用）。第二章-DNA重组克隆的单元操作载体必须具备的三个条件具有复制原点或整合位点，能使外源基因在受体细胞中稳定遗传。既有多种单一的核酸内切酶的识别切割位点（多克隆位点，multi-clonesite,MCS)。具有合适的选择性标记，便于重组DNA分子的检测。第二章-DNA重组克隆的单元操作一、质粒载体（一）质粒的基本性质存在于细菌或真菌的细胞质粒是染色体外稳定遗传的复制体，其特点共价、闭环，双链DNA分子（covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)。大多数质粒具有复制原点，能独立进行复制，不依赖寄主的细胞复制周期质粒第二章-DNA重组克隆的单元操作（一）质粒的基本性质质粒通常赋予寄主一些表型特征，如抗生素抗性等。选择性标记(selectablemarker):由于质粒携带的基因，可供实验室条件下进行选择的一些标记。如抗性，营养元素的利用等。显性质粒与隐性质粒.一、质粒载体第二章-DNA重组克隆的单元操作（一）质粒的基本性质1、质粒的自主复制性：含有Ori或replicon质粒在特定的宿主细胞中维持恒定的拷贝数。A、反义RNA进行调控的机制B、关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理一、质粒载体第二章-DNA重组克隆的单元操作A、反义RNA进行调控的机制（plasmidColE1）RopdimerPRNAIIRNAIIa、在复制起点处，RNAII（长555个碱基）与质粒DNA形成RNA-DNA复合物，RNA酶H可降解RNAII，露出3’自由羟基，质粒复制起始。在该区域还能反向转录形成RNAI，I和II为互补的RNA。第二章-DNA重组克隆的单元操作B、如果RNAI和RNAII形成双链RNA螺旋，RNA酶H不能降解RNAII，复制不能进行。RopdimerPRNAIIRNAII第二章-DNA重组克隆的单元操作c、当质粒的浓度比较高的时，Rop蛋白促进RNAI和RNAII形成双链RNA螺旋，使质粒的复制不能起始。d、当质粒的比较低时，RNAII与质粒DNA形成RNA-DNA复合物，RNA酶H降解RNAII质粒复制起始。e、突变RNAI或去除Rop基因导致质粒的拷贝数增加。第二章-DNA重组克隆的单元操作B、关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理（pS101质粒）a)复制原点区域含有3～7拷贝的长度为17～22bp的重复区域，R1、R2、R3等。第二章-DNA重组克隆的单元操作B、关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理

b)复制原点附近有一个编码基因repA,编码RepA蛋白。RepA是双功能的蛋白：与复制原点区域的重复序列结合，起始DNA的合成；与自身基因的启动子结合，抑制自身的转录。第二章-DNA重组克隆的单元操作质粒拷贝数由RepA蛋白浓度和质粒自身的浓度进行调节。

如果质粒拷贝数高，RepA蛋白与自身的启动子区域结合，抑制转录，RepA蛋白合成受阻，DNA的复制受到抑制。RepA蛋白通过结合到两个质粒的重复序列把它们连接起来，避免复制起始。细胞分裂后，拷贝数和RepA蛋白的浓度降低，RepA蛋白自身合成增加，结合到重复区域起始DNA的合成。B、关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理

第二章-DNA重组克隆的单元操作问题：在寄主复制后，质粒是如何分配到子细胞中？

Par原件会附着在细胞膜上，随着细胞的分裂，质粒正确分配到子细胞中，维持相对稳定的质粒拷贝数。第二章-DNA重组克隆的单元操作（一）质粒的基本性质2、质粒的可扩增性（质粒的拷贝数）拷贝数：细胞中质粒的数量（摩尔数）与染色体DNA数量之比

严谨型:少数拷贝存在于细胞中（1~几个）

松弛型:多个拷贝存在于细胞中（≥10）严谨型与松弛型是相对的。第二章-DNA重组克隆的单元操作（一）质粒的基本性质3、不相容性在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞系中稳定地共存的现象，称为质粒的不相容性，或称为不亲和性（Plasmidincom-patibility)。这样的两种质粒称为不亲和质粒第二章-DNA重组克隆的单元操作（一）质粒的基本性质引起质粒的不相容的机理A具有相同的复制调控机制B控制质粒分配的par元件相同,也会引起质粒的不相容不相容群：指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子ColE1/pMB1第二章-DNA重组克隆的单元操作（一）质粒的基本性质4、质粒的可转移性（p13)第二章-DNA重组克隆的单元操作（二）、质粒的改造和构建天然的野生质粒一般不能直接用作克隆载体，需要改造1、删除不必要的DNA序列，缩小质粒相对分子量，提高外源DNA片段的装载量。2、灭活一些质粒的基因（如可转移基因），保证重组实验的安全；灭活质粒拷贝数的负控制基因，提高质粒的拷贝数。3、加入选择性标记，便于重组子的检测4、加入多克隆位点，便于外源基因的插入5、根据克隆的目的，加装特殊的表达元件或便于蛋白纯化的元件（GST标签）第二章-DNA重组克隆的单元操作R7268ApRR1drd19ApRCmRSmRSuRKmRpMB3ApRpSF2124ApRpBR312ApRTcRpSC101TcR12pM88pMB9TcR34ColE1566pBR313ApRTcRpBR322ApRTcR78pMB1(b)例:第一个人工构建的遗传载体pBR322第二章-DNA重组克隆的单元操作（三）、质粒的分类及用途1、克隆质粒：能在宿主细胞中高拷贝存在（含有氯霉素可扩增的松弛型复制子或解除了对质粒拷贝数的负控制作用）。2、测序质粒:能高拷贝复制，含有MCS，含有通用的引物序列（如SP6，T7），能形成单链模板，便于测序反应的进行。3、整合质粒：含有整合酶编码基因以及整合特异性位点序列，克隆在这种质粒上的外援基因进入受体细胞后，能准确重新整合在染色体DNA的特点位点上（如动物植物细胞中用于目的基因敲除的载体，见第五章、第六章）。第二章-DNA重组克隆的单元操作第二章-DNA重组克隆的单元操作（三）、质粒的分类及用途4、穿梭载体（shuttlevector）质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子以及相应的选择性标记，能在两种不同的受体细胞中复制并检测。如大肠杆菌-酵母穿梭质粒。特点：克隆在这类载体上的外源基因不需要更换载体直接从一种受体菌转入另一种受体菌复制并且遗传。第二章-DNA重组克隆的单元操作三、质粒的分类及用途5、探针质粒：用来筛选克隆基因的表达调控元件。通常含有报告基因，但缺少相应的调控序列（如启动子或终止子），只有含有启动子或终止子的调控序列被克隆进入载体后，报告基因才能别表达，表达量的大小直接反应了克隆进入的调控元件的强弱。第二章-DNA重组克隆的单元操作无启动子序列报告基因第二章-DNA重组克隆的单元操作（三）、质粒的分类及用途6、表达质粒在多克隆位点的上下游分别装有两套转录效率较高的启动子、合适的核糖体结合位点序列（SD）序列以及强有力的终止子结构，使得克隆在合适位点上的任何外源基因均能在受体细胞中高效表达。如pET载体。常用的载体见表格2-1（p16)第二章-DNA重组克隆的单元操作MCS复制原点选择标记高效启动子终止子序列核糖体结合位点第二章-DNA重组克隆的单元操作pGEM载体—克隆DNA的体外转录加入了两个短片段，这两个片段在限制性酶切位点的两侧，可被T7噬菌体的RNA聚合酶或SP6T7噬菌体的RNA聚合酶的识别方便了克隆DNA的体外转录，便于研究RNA加工，合成蛋白质等的研究等6、表达质粒第二章-DNA重组克隆的单元操作pGEM-3Z多拷贝装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’装有两个噬菌体的强启动子用于外源基因的高效表达注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如E.coliBL21（DE3）等AproripGEM-3Z2743bplacZ’PT7MCSPSP6第二章-DNA重组克隆的单元操作（四）、质粒DNA的制备1基于分子大小的分离2基于构象的分离质粒有三种构型cccDNA(共价闭环DNA)：DNA的两条链都是完整的。ocDNA(开环DNA)：只有一条链是完整的。线性DNA：DNA的两条链均被打开。多种细菌中存在线性的质粒DNA。但末端或是通过重复序列形成发卡结构或通过共价结合蛋白进行保护，避免核酸酶的降解。第二章-DNA重组克隆的单元操作超螺旋DNA松弛cccDNA开环DNA核酸内切酶DNA连接酶核酸内切酶DNA促旋酶拓扑异构酶第二章-DNA重组克隆的单元操作碱变性用CsCl-EB等密度离心UpperbandcontainingchromosomalDNAandopenplasmidcirclesLowerbandofcovalentlyclosedcirclesplasmidDNAEthidiumbromide(EB)电泳方向cccDNAL-DNAOC-DNACKRZ第二章-DNA重组克隆的单元操作总结质粒载体1、质粒载体的基本性质：自我复制能力、拷贝数的控制、严谨型和松弛型质粒、质粒的不相容性及机理2、质粒载体具备的特点3、质粒载体的分类：克隆载体、测序载体、穿梭载体、表达载体和探针载体等的特点第二章-DNA重组克隆的单元操作（一）、噬菌体的生物学特征λ噬菌体颗粒中的DNA是一线性双链DNA分子，长48502bp。基因簇集排列线λ噬菌体上有些基因可被取代而不影响其生活周期线性λ噬菌体两端各有12个碱基的5’凸出黏性末端是互补的,该互补序列相互作用形成cos位点。

作用：进入细胞的λDNA通过两端的黏性末端环化。

二、λ双链噬菌体DNA载体第二章-DNA重组克隆的单元操作第二章-DNA重组克隆的单元操作第二章-DNA重组克隆的单元操作第二章-DNA重组克隆的单元操作1、对野生λ噬菌体的改进A、删除多余的限制性内切酶的位点。B、切除一些非必需序列，增加载体的容量。

C、设计阳性选择重组子的方法。

D、发展可以使插入的真核cDNA与β－半乳糖苷酶形成融合蛋白的载体。

（二）、基于λ噬菌体的克隆载体第二章-DNA重组克隆的单元操作2、λ噬菌体基因组可删除的部分不影响生存能力λ噬菌体基因组中可以删除的序列与噬菌体进入从裂解状态进入溶源状态以及从溶源状态进入裂解状态有关，即与噬菌体整合和脱离大肠杆菌的染色体相关删除了这部分序列的噬菌体只能进行裂解循环（二）、基于λ噬菌体的克隆载体第二章-DNA重组克隆的单元操作3、重组噬菌体的鉴别（1）lacZ′基因功能选择方法类似于质粒中的蓝白斑筛选（2）cI基因功能选择法cI插入失活的噬菌斑是“清澈”的，而野生型正常的噬菌斑是“浑浊”的浑浊清亮第二章-DNA重组克隆的单元操作3、重组噬菌体的鉴别（3）Spi-（sensitivetoP2inhibition）正选择A野生型λ噬菌体，不能在P2噬菌体溶源性细菌中生长，为Spi+，即对在P2噬菌体的抑制呈敏感反应。Bλ噬菌体载体中的red和gam区段被外源片段取代后，λ噬菌体就能在P2噬菌体溶源性细菌中生长。第二章-DNA重组克隆的单元操作3、重组噬菌体的鉴别（4）、基于λ基因组大小的筛选包装体系只能将大小37~52Kb的DNA分子插入到噬菌体的头部结构中插入型载体通常删除了噬菌体的中非必须的基因部分，因此中有重组后介于37~52Kb的分子才能被包装。第二章-DNA重组克隆的单元操作（左右臂连接）（三段自身连接）（插入片段）第二章-DNA重组克隆的单元操作根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选第二章-DNA重组克隆的单元操作插入型载体：只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。失去了非必需区切点又位于报告基因上，故在切开DNA并插入外源基因后，报告基因失活，即可依此进行重组体的筛选可插入长度为10kb的外源DNA

（三）、λ噬菌体载体分类第二章-DNA重组克隆的单元操作两种报告基因的插入型载体cI基因内保留HindIII和EcoRI单酶切位点，当有外源DNA在这酶切位点插入时，使cI基因失活，感染hfⅠ-大肠杆菌后可形成空斑（如λgt10）。在噬菌体DNA插入的lacZ基因末端设有单一的EcoRⅠ酶切位点。在此处插入外源基因，可表达β-半乳糖苷酶的融合蛋白，利用特异性抗体或DNA测序方法可筛选重组DNA。这类载体适宜构建cDNA文库(如λZAPII)（三）、λ噬菌体载体分类第二章-DNA重组克隆的单元操作cIEcoRILA32.7RA10.6λgt10

lacZLA19.9RA21.9EcoRICharon16A第二章-DNA重组克隆的单元操作取代型载体：具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的λDNA区段可以被外源插入的DNA所取代。可克隆的片段大，最大可达25kb，而质粒最大仅10kb左右；λDNA的长度介于野生型λ噬菌体DNA长度的75％而不超过其105％时，才能被包装成噬菌体颗粒，当DNA的长度短于野生型的75%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降，因此要求λ载体DNA和外源DNA长度之和在39～53kb之间。（三）、λ噬菌体载体分类第二章-DNA重组克隆的单元操作LacZEcoRIEcoRIEcoRIBanHISalISalIBamHIEcoRIMCSMCSCharon4AEMBL3/4Charon40第二章-DNA重组克隆的单元操作（四）λ克隆载体的体外包装

（补充知识）体外包装：模拟λ噬菌体DNA分子在宿主细胞内发生的包装过程，将重组的λ噬菌体DNA分子包装成成熟的具有感染能力的λ噬菌体颗粒必要性：

λ噬菌体重组分子直接感染大肠杆菌的效率较低，而在试验过程中，因内切酶的处理，DNA的连接产生的有效分子等原因，使得转染效率更低第二章-DNA重组克隆的单元操作（四）λ克隆载体的体外包装第二章-DNA重组克隆的单元操作（四）λ克隆载体的体外包装单菌株体系缺陷型λ噬菌体在cos位点有突变，λ噬菌体的DNA复制不能完成，但可形成外壳蛋白，可以制备包装所必须的各种外壳蛋白。第二章-DNA重组克隆的单元操作（四）λ克隆载体的体外包装双菌株的体外包装原理Aλ噬菌体的头部和尾部的包装是分开进行B头部基因发生突变的噬菌体只能形成尾部C尾部基因发生突变的噬菌体只能形成头部D两种不同突变的噬菌体混合起来，能在体外装备形成有活性的噬菌体颗粒第二章-DNA重组克隆的单元操作Lyse,mixAddATPandconcatemerizedλDNAMaturephageparticles第二章-DNA重组克隆的单元操作（五）λ-DNA分离与纯化1、含有乳糖和MgCl2的LB培养基中培养大肠杆菌2、加入合适滴度的重组λ噬菌体悬浮液3、用LB继续培养，至溶液从浑浊变为清亮4、加入固体NaCl和PEG8000,离心获得噬菌体颗粒5、蛋白酶K处理噬菌体悬浮液，去除蛋白质6、乙醇或异丙醇沉淀λ噬菌体DNA第二章-DNA重组克隆的单元操作总结有关λ噬菌体改造的载体λ噬菌体的生物学特点改造野生型λ噬菌体称为载体需要去除和加入的功能元件有哪些？λ噬菌体重组体的筛选有哪些方法？λ噬菌体载体的类型和特点。第二章-DNA重组克隆的单元操作三、M13单链噬菌体DNA载体（一）M13噬菌体一般特点仅6407个核苷酸，10个基因有双链环状，单链环状存在形式基因组采取滚环复制形式适合做载体具有比λ噬菌体更大的装载能力单链形式在某些实验过程很重要，如测序、体外突变等第二章-DNA重组克隆的单元操作RFDNA第二章-DNA重组克隆的单元操作第二章-DNA重组克隆的单元操作（二）M13-DNA的改造1、定点诱变的方法封闭重复的酶切位点2、引入合适的选择标记基因，如抗生素抗性基因，LacZ’3、引入多克隆位点4、在多克隆位点两侧引入测序引物第二章-DNA重组克隆的单元操作野生型M13RF-DNAM13mp系列载体polylinkerlacZ'IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII第二章-DNA重组克隆的单元操作宿主菌缺陷型缺失N端第11－41位氨基酸：β-半乳糖苷酶没有生物活性未插入外源基因的M13mp1与该缺陷型基因可以产生互补插入外源基因的M13mp1与宿主不互补编码β-半乳糖苷酶N端146氨基酸的基因序列M13mp系列载体polylinkerlacZ‘第二章-DNA重组克隆的单元操作Blue-whiteselection第二章-DNA重组克隆的单元操作四、噬菌体-质粒杂合载体（一）粘粒载体（柯斯质粒载体，cosmidvector）

1、定义人工构建的含有λDNA的cos（cohesive-endsite)位点序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。第二章-DNA重组克隆的单元操作pHC796.4kb柯斯质粒载体pHC79图由pBR322质粒DNA与λ噬菌体DNA的cos位点及其控制包装作用的序列构成第二章-DNA重组克隆的单元操作2、柯斯质粒载体的特点（1）只具有λ噬菌体的包装特性，重组分子导入受体细胞按λ噬菌体的方式进行。（2）具有质粒的特性（有质粒复制子、抗生素基因和相应的多克隆位点）；（3）具有高容量的克隆能力（本身仅5-7kb,克隆极限可达45kb左右）广泛应用于基因组DNA文库的构建。（一）粘粒载体（柯斯质粒）第二章-DNA重组克隆的单元操作（二）噬菌粒载体1、一般特点由丝状噬菌体DNA复制起始位点序列与质粒组合形成的杂合分子。将M13噬菌体基因II和IV之间的DNA复制起始、终止和包装识别序列克隆进入质粒载体，形成噬菌粒。第二章-DNA重组克隆的单元操作（二）噬菌粒载体2、优点A、具有质粒的基本性质，便于外源DNA的克隆和重组子的选择B、具有更高的装载容量C、比M13-DNA重组分子更具有遗传稳定性，在复制时不会发生DNA缺失第二章-DNA重组克隆的单元操作五、人工染色体载体1、BAC（bacterialartificialchromosome）A、以大肠杆菌（E.coli）F性因子为基础构建的载体。B、特点：容纳大约200Kb的片段可以像大肠杆菌的质粒一样繁殖（低拷贝，严谨型）在宿主细胞中不会发生重组第二章-DNA重组克隆的单元操作五、人工染色体载体2、P1以及PAC载体（Pl-derivedArtificialChromosome）组件：

包装位点（pac）：体外包装重组子成为噬菌体粒子所必需。

两个loxP位点：能被噬菌体重组酶（cre基因的产物）所识别具有P1和F-因子的特性能插入100-300Kb片段第二章-DNA重组克隆的单元操作补充知识点Cre重组酶：于1981年从P1噬菌体中发现，属于λInt酶超基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp（EMBL数据库登录号X03453），编码38kDa蛋白质。是一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。LoxP（locusofX-overP1）序列：来源于P1噬菌体，是有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。其序列如下：

ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT第二章-DNA重组克隆的单元操作+CrerecombinaseproteincircularizesinjectedDNAattheloxPsites.DNA-replicatesusingplasmidreplicon,PlasmidcopynumberisincreasedbyinductionofP1lyticreplicon.PacextractcleavesatpacsiteandinsertsDNAintop1heads.TailsareattachedAllowphagetoadsorbtohoststrainandinjectDNAintocre+hostcell.第二章-DNA重组克隆的单元操作正常酵母人工染色体含有：*四膜虫端粒（tel)*酵母自主复制序列（ARS)*酵母着丝点(CEN)*酵母的选择标记(TRP1、URA1)YAC载体第二章-DNA重组克隆的单元操作第二节DNA的体外重组目标DNA与载体在体外连接，形成新的DNA分子。涉及到各种工具酶第二章-DNA重组克隆的单元操作一、序列特异的DNA限制性内切核酸酶

λ噬菌体E.coli菌株λKλCλBK110-410-4B10-4110-4C111（一）限制性内切酶的发现第二章-DNA重组克隆的单元操作（一）限制性内切酶的发现

—宿主细胞的限制和修饰作用1、宿主细胞的限制和修饰作用：两种不同来源的入-噬菌体λK；λB，能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（K株，B株）。当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下降数千倍。一但λK噬菌体在B株成功，由B株繁殖出λK后代，能感染B株,不能感染原来K株.第二章-DNA重组克隆的单元操作(二)限制和修饰作用的分子机制1．大肠杆菌宿主细胞K株，B株，有各自的限制和修饰系统。

1）

它们均有三个连续的基因位点控制，hsdR;hsdM;hsdS.2）

hsdR编码限制性核酸内切酶---识别DNA分子特定位点，将双链DNA切断。

3）

hsdM编码产物是DNA甲基化酶---催化DNA分子特定位点的碱基甲基化反应。

4）

hsdS表达产物的功能是---协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别特殊的作用位点。第二章-DNA重组克隆的单元操作(二)、限制和修饰作用的分子机制2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞K株，B株中，

1）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA和噬菌体DNA特异性保护.2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点（修饰）3．当外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解（限制）4.由于降解不完全，外来少数DNA分子在宿主细胞中繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。第二章-DNA重组克隆的单元操作5．但丧失在原宿主细胞中的存活能力，因为接受了新宿主菌甲基化修饰的同时丧失了原宿主菌修饰的标记(一但λK噬菌体在B株成功，由B株繁殖出λK后代，能感染B株,不能感染原来K株)6．细菌利用限制和修饰系统来区分自身DNA与外来DNA。C株不能产生限制性内切酶，其它来源入-噬菌体可以感染C株，在C株繁殖，其产生噬菌体则在K株和B株受到严格的限制作用(二)限制和修饰作用的分子机制第二章-DNA重组克隆的单元操作(三)限制性内切酶的分类I类酶II类酶III类酶酶分子三亚基双功能内切酶与甲基化酶分离二亚基双功能识别位点二分非对称序列4-8bp序列，回文结构5-7bp非对称序列切割位点距识别位点1000bp在识别位点中或靠识别位点在识别位点下游24-26bp限制性反应与甲基化反应互斥分开反应同时竟争限制作用需要需要不需要第二章-DNA重组克隆的单元操作酶的命名3.

命名（1973年Smith原则、Ⅱ型酶）根据分离此酶微生物的学名，一般取3个字母。第一个字母大写该微生物属名前的第一个字母第二、三个字母小写该微生物种名前的2个字母第四个字母大写有变种或品系的第一个字母罗马字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ从一种微生物中发现了几种限制酶，按发现顺序排列如EcoRⅠ是指从大肠杆菌（Escherichiacoli）R株分离得到的第一种限制酶。第二章-DNA重组克隆的单元操作（四）限制性内切酶Ⅱ切割特点1、识别位点一般为4-8个bp的回文序列大多数酶作用于底物DNA双链，位点在识别序列中或靠近识别序列少数酶能作用于回文序列相应DNA单链序列第二章-DNA重组克隆的单元操作限制性内切酶Ⅱ切割特异位点的机理第二章-DNA重组克隆的单元操作（四）限制性内切酶Ⅱ切割特点平末端：两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，形成的DNA片段具有平末端。黏性末端：指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。

5’突出的黏性末端

3’突出的黏性末端第二章-DNA重组克隆的单元操作平末端的DNA片段不易重新环化第二章-DNA重组克隆的单元操作已知有两种不同的限制酶都可产生粘性末端：5’-P端突出：3’-OH端突出：第二章-DNA重组克隆的单元操作同尾酶一组来源不同识别序列各异的，但能够切割形成相同粘性末端的核酸内切限制酶。第二章-DNA重组克隆的单元操作HindⅢ5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’HsuI5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’同裂酶（isoschizomers）有一些来源不同的限制性内切酶能识别并切割相同的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。第二章-DNA重组克隆的单元操作限制酶识别与切割的靶点序列及其随后的连接同DNA的来源无关，即不带有种的特异性，对各种DNA普遍适用。根据这一特性，才能将不同来源的DNA片段重组成新的重组体分子或是新的基因。第二章-DNA重组克隆的单元操作（五）甲基化酶对内切酶识别的影响为限制性内切酶的伙伴，其识别位点与相应的限制性内切酶相同，并在识别序列内使某位碱基甲基化，对基因组甲基化后，内切酶识别发生的变化：1）封闭了内切酶的切口。如M.EcoRⅠ2）一些依赖甲基化的限制性内切酶的切口产生5′—TCGATCGA—3′5′—TCGA*TCGA*—3′5′—AGCTAGCT—3′5′—A*GCTA*GCT—3′TaqITaqIDpnI第二章-DNA重组克隆的单元操作（五）甲基化酶对内切酶识别的影响3）增加了部分酶的识别特异性。大肠杆菌基因组内存在两种甲基化酶,Dam和Dcm5′—ATCGAT—3′ClaI5′—GA*TCGAT—3′5′—ATCGA*TC—3′4）部分酶对其识别序列内的碱基是否甲基化，不影响切割5′—(C/T/A)ATCGAT(T/A/G)—3′ClaI第二章-DNA重组克隆的单元操作二、连接酶第二章-DNA重组克隆的单元操作（一）DNA连接酶的作用模式1、连接酶：能够催化两条双链DNA链之间形成3′

，5′磷酸二酯键的酶5’－末端形成DNA－腺苷酸复合物第二章-DNA重组克隆的单元操作（二）DNA连接酶的两种类型类型I：E.coliDNA连接酶（只连接粘末端）利用NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）作为能量供体，主要来源于原核生物类型II：T4DNA连接酶（粘末端和平末端）

利用ATP作为能量供体，主要来源于真核生物，T4噬菌体也属于此类在基因工程的实验中主要用T4DNA连接酶第二章-DNA重组克隆的单元操作（三）条件（1）连接所需的条件一条DNA链的3’末端具有一个游离的羟基（-OH），而在另一条DNA链的5’末端具有一个磷酸基团（-P）；（2）需要有一种能源分子存在以提供羟基与磷酸基团之间形成磷酸二酯键时所需的能量。大肠杆菌及其它细菌中：NAD+（氧化氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）动物细胞及噬菌体中：ATPOH3’5’P第二章-DNA重组克隆的单元操作（四）注意被连接的两条DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分，DNA连接酶并不能连接两条单DNA分子或环化的单链DNA分子。DNA连接酶只能连接并封闭双螺旋DNA分子所出现的切口（Nick），即封闭双链DNA上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的断裂第二章-DNA重组克隆的单元操作GGTAC-OHP-CC-PHO-CATGG5’3’3’5’GG-OHP-CCCCATGG5’3’3’5’GGTACCCCATGG5’3’3’5’第二章-DNA重组克隆的单元操作三、其他用于DNA重组的工具酶1、DNA聚合酶Ⅰ（来自大肠杆菌）功能：5’→3’的聚合酶活性。5’→3’外切核酸酶活性，3’→5’外切核酸酶利用：5’→3’的聚合酶活性以及5’→3’外切核酸酶活性，切口平移大片段（Klenow片段）：5’→3’的聚合酶活性，3’→5’外切核酸酶小片段DNA聚合酶Ⅰ第二章-DNA重组克隆的单元操作第二章-DNA重组克隆的单元操作TaqDNA聚合酶（来自耐热细菌）具有5’→3’的聚合酶活性和3’→5’外切核酸酶，高度保真。耐高温。T4DNA聚合酶：具极强3’→5’外切核酸酶活性，可修平非平头的DNA分子。测序酶：具有5’→3’的聚合酶活性，但不具备3’→5’外切核酸酶的T7DNA聚合酶。反转录酶：以mRNA为模板合成DNA的聚合酶第二章-DNA重组克隆的单元操作2、末端脱氧核苷酰转移酶不需要模板的DNA聚合酶，底物为带有游离3′端的羟基的双链DNA分子。三、其他用于DNA重组的工具酶5′3′OH+Mg2++dATP+TdT5′3′AAAAAAAA5′3′OH5′3′AAAAAAAA+Co2++dATP+TdT5′3′OH+Co2++dATP+TdT5′3′AAAAAAAAA3′突出端平端3′凹端第二章-DNA重组克隆的单元操作3、S1核酸酶以外切或内切的方式降解单链RNA或DNA。4、Bal31核酸酶三、其他用于DNA重组的工具酶第二章-DNA重组克隆的单元操作三、其他用于DNA重组的工具酶5、碱性磷酸酯酶：除去DNA5′磷酸的酶6、激酶：在DNA或RNA的5′羟基(OH)端进行磷酸化的酶（作用结果是添加磷酸，可用于核酸的末端标记）第二章-DNA重组克隆的单元操作四、DNA切接反应的影响因素（一）、限制性内切酶切割反应合适的缓冲液（10~50mMTris-HCl,pH7.5);10mMMgCl2、1mMDTT对NaCl的浓度要求不同，可以分为低盐组中盐组高盐组双酶切反应的原则A、盐浓度要求相似的内切酶可在一个反应体系中做双酶切反应B、先做低盐反应酶切再做高盐反应的酶切C、考虑双酶切位点的核苷酸排列第二章-DNA重组克隆的单元操作四、DNA切接反应的影响因素星号活性在非理想条件下，酶的专一性降低，导致内切酶切割与其识别序列相似序列的现象，称为限制性内切酶的星号活性。如EcoRI5′—GAATTC—3′EcoRI低盐、高pH值、过量甘油5′—AAATTC—3′5′—GAGTTC—3′第二章-DNA重组克隆的单元操作四、DNA切接反应的影响因素（二）、T4-DNA连接酶的连接反应缓冲液体系：50~100mMTris-HCl（pH7.5）10mMMgCl2、1mMDTT，≤1mMATP过量的甘油抑制反应温度、离子浓度、DNA末端的性质、DNA片段的大小；载体和外源基因的摩尔比因大多数内切酶产生的黏性末端退火温度在15度以下，故连接反应一般在低温下进行（16度以下）。第二章-DNA重组克隆的单元操作（三）重组率及其影响因素1、由同一种酶切割的载体分子和目标DNA片段在连接时会产生三种连接产物：载体自连外源DNA片段自连载体+外源DNA片段的连接产物（目标重组产物）2、提高重组产物的方法：增加外源片段与载体片段的比值（3~8:1)载体DNA的5′去磷酸化用末端转移酶分别处理载体和目标片段，使它们带有互补的末端四、DNA切接反应的影响因素第二章-DNA重组克隆的单元操作1、互补黏性末端之间的连接同一限制酶切割位点连接：

由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要酶切割DNA后产生单链突出（5‘突出及3’突出）的粘性末端，同时酶切位点附近的DNA序列不影响连接，那么，当这样的两个DNA片段一起退火时，粘性末端单链间进行碱基配对，然后在DNA连接酶催化作用下形成共价结合的重组DNA分子。具有两个插入方向两个限制性内切酶切割位点连接：只可一种方向插入同尾酶切割位点连接：发生酶切口的焊死作用五、DNA分子重组的方法第二章-DNA重组克隆的单元操作五、DNA分子重组的方法2、平末端之间的链接DNA连接酶可催化相同和不同限制性核酸内切酶切割的平端之间的连接。原则上讲，限制酶切割DNA后产生的平端也属配伍末端，可彼此相互连接；若产生的粘性末端经特殊酶处理，使单链突出处补齐或削平，变为平端，也可实行平端连接。操作方法同黏性末端之间的链接，增加酶的用量。提高连接反应温度；增加DNA平头末端的浓度等。第二章-DNA重组克隆的单元操作3、将粘末端加到平末端分子上DNA接头同聚物加尾产生粘性末端PCR产物的克隆连接（特例）五、DNA分子重组的方法第二章-DNA重组克隆的单元操作DNA接头第二章-DNA重组克隆的单元操作

同聚物加尾连接是利用同聚物序列，如多聚A与多聚T之间的退火作用完成连接。在末端转移酶(terminaltransferase)作用下，在DNA片段端制造出粘性末端，而后进行粘性末端连接。这是一种人工提高连接效率的方法，也属于粘性末端连接的一种特殊形式。dATPdTTP同聚物加尾产生粘性末端第二章-DNA重组克隆的单元操作PCR产物的克隆连接PCR反应中所使用的聚合酶具有末端转移酶的活性，通常在3’末端加上A。经特使处理的载体具有3’突出T碱基，通过T/A互补，进行克隆。属于黏性末端的连接，该克隆方式特称TA克隆。第二章-DNA重组克隆的单元操作从生物秀网站下载第二章-DNA重组克隆的单元操作4、定向克隆将外源DNA按正确的方向插入载体。通常采用不同的内切酶分别处理载体和片段，使线性载体和片段的两段带有不同的粘性末端，通过载体与片段之间的连接，实现定向克隆。第二章-DNA重组克隆的单元操作第三节重组DNA分子的转化与扩增第二章-DNA重组克隆的单元操作一、概念将重组DNA分子，导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，该导入过程及操作系统称之为重组DNA分子的转化。两个条件：可转化的DNA分子受体细胞第二章-DNA重组克隆的单元操作细菌转化的过程（革兰氏阳性菌）1、感受态的形成细胞分泌激活蛋白→与细胞表面受体结合→诱导特征性蛋白质（如细菌溶素）合成→细胞壁部分溶解→暴露细胞膜上的DNA结合蛋白和核酸酶2、转化因子的结合：细胞膜上的DNA结合蛋白与双链DNA特异结合。第二章-DNA重组克隆的单元操作3、转化因子吸收：DNA+蛋白质→激活核酸酶→DNA一条链被降解，另一条链进入到受体细胞中4、整合复合物前体的形成：单链DNA+细胞中游离蛋白质→形成整合复合物前体结构（避免细胞内各种核酸酶的攻击）→引导进入受体细胞染色体DNA处。5、同源重组的方式置换受体DNA的同源区域细菌转化的过程（革兰氏阳性菌）第二章-DNA重组克隆的单元操作二、受体细胞的选择1、限制缺陷型的细胞：将相应细胞中的内切酶失活（如大肠杆菌中的hsdR，使之变成hsdR-

突变株系）2、重组缺陷型细胞转入的外源DNA分子能够自主复制，一般不需要将DNA重组到染色体DNA，因此受体细胞应该是重组相关的酶的突变株系(如大肠杆菌中recA-,recB-,recC-第二章-DNA重组克隆的单元操作二、受体细胞的选择3、转化亲和型：使细胞壁的通透性增高，提高转化效率；噬菌体受体菌细胞膜上需有特异性吸附的相关受体。4、遗传互补型：受体细胞与载体上的选择标记具有互补的遗传性状。如载体上具有抗生素基因，细菌细胞中就应该没有该基因或该基因突变，这样受体细胞接受外源DNA后，就会获得载体上的选择标记的性状，这样可筛选外源基因表达的转化细胞。第二章-DNA重组克隆的单元操作二、受体细胞的选择5、感染寄生缺陷型对于人体和牲畜有害的细菌，在作为受体时，需将其感染寄生能力突变，从而具有生物安全性。第二章-DNA重组克隆的单元操作三、转化方法动植物细胞通常应病毒感染的方法，将外源DNA导入细胞。细菌细胞方法如下：1、Ca2+诱导转化外膜与内膜间的部分核酸酶离开细胞膨胀细胞膜磷酯层形成液晶感受态加入DNA羟基磷酸钙-DNA复合物核酸酶不能降解42℃处理膜液晶结构发生变化，通透性增加，DNA进入细胞低渗CaCl2溶液第二章-DNA重组克隆的单元操作三、转化方法2、PEG介导的细菌原生质体转化对数生长期的细胞→适量溶菌酶等渗溶液→原生质体（膜上DNase）→环状DNA分子的吸收→DNA样品+PEG→涂布在固体培养基上→细胞壁再生→通过选择标记筛选转化细胞。3、电转化电场脉冲作用下→细胞壁形成微孔通道→DNA与细胞膜结合，引发吸收。转化分子量大的DNA比较有效。第二章-DNA重组克隆的单元操作三、转化方法4、接合转化接合：细菌细胞间的直接接触导致DNA从一个细胞转移至另一个细胞的过程。接合质粒介导：促进细胞有效接触、诱导DNA分子传递转移第二章-DNA重组克隆的单元操作接合转化过程供体菌(待转化的重组质粒的菌株），不能在最小培养基中生长，但抗生素XR辅助菌(含辅助质粒的菌株），不能在最小培养基中生长，但抗生素YR受体菌,能在最小培养基中生长在无抗生素的培养基中混合培养一段时间后含有X+Y的最小培养基第二章-DNA重组克隆的单元操作四、转化率及其影响因素1、转化率的定义定义1：待转化的DNA分子远大于受体细胞的条件下，转化细胞与细胞总数之比。定义2：受体细胞相对于DNA分子大大过量时，每微克DNA转化所产生克隆数。（每微克DNA进入受体细胞的分子数）第二章-DNA重组克隆的单元操作四、转化率及其影响因素2、转化率的用途参照已知转化率和重组率可以帮助设计DNA重组实验的规模，如平板的制备数量第二章-DNA重组克隆的单元操作四、转化率及其影响因素3、转化率的影响因素载体DNA及重组DNA：构象和大小受体细胞转化操作：选择适合转化方法和优化操作流程第二章-DNA重组克隆的单元操作2.3.5转化细胞的扩增转化细胞的增殖载体携带标记基因拷贝数扩增及表达克隆外源基因的表达第二章-DNA重组克隆的单元操作2.4转化子的筛选与重组子的鉴定非转化子：未接纳载体或重组子的非转化细胞转化子：接纳载体或重组分子的的转化细胞重组子：含有重组DNA分子的转化子非重组子：含有空载体分子的转化子期望重组子：含有目的基因的重组子非期望重组子：不含目的基因的重组子第二章-DNA重组克隆的单元操作2.4.1基于载体遗传标记的筛选与鉴定载体DNA分子上多携带的选择性遗传标记基因筛选转化子或重组子。在合适的培养基上：转化子生长（菌落或噬菌斑）非转化子不生长第二章-DNA重组克隆的单元操作2.4.1.1抗药性筛选方法载体上含有