动物酶工程与蛋白质工程

酶的发酵生产DNA重组含义BA酶的发酵生产概念微生物酶的发酵生产酶的发酵生产1、概念1.1.1、产酶细胞1.1.2优良的产酶细胞应具备的条件1.1.3微生物作为酶生产来源的主要原因1.1.4酶发酵生产的流程

1.1概念

指利用产酶细胞在适宜的发酵工艺条件下生产酶制剂的过程。酶的发酵生产1.1.1产酶细胞

微生物细胞、植物细胞、动物细胞。条件1.1.2优良的产酶细胞应具备的条件05安全可靠04利于酶的分离纯化03产酶稳定性好01酶的产量高02容易培养和管理主要原因011.1.3微生物作为酶生产来源的主要原因1.1.3微生物作为酶生产来源的主要原因（一）微生物生长繁殖快，产量高（二）微生物培养方法简单（三）微生物菌株种类繁多。（四）有较强的适应性和应变能力。1.1.4酶发酵生产的流程选择合适的产酶菌株微生物生长、繁殖微生物合成所需酶

酶的分离、纯化酶制剂微生物酶的发酵生产2.1概念2.2发酵工艺条件及控制

2.2.1产酶细胞的保藏（低温）2.2.2细胞活化与扩大培养2.2.3培养基的配制微生物酶的发酵生产2.1概念

微生物酶的发酵生产是指在人工控制的条件下，有目的地利用微生物培养来生产所需的酶。所需技术包括培养基和发酵方式的选择及发酵条件的控制。2.2.1产酶细胞的保藏（低温）:0~4℃2.2发酵工艺条件及控制2.2.2细胞活化与扩大培养2.2.3培养基的配制（一）碳源：2、酶发酵生产常用的碳源甘薯、麸皮、玉米、米糠等淀粉质原料。

1、选择原则：①营养②对酶生物合成具有调节作用③原料的供求和价格氮源01选择原则（二）氮源

①根据不同的细胞要求选择；②注意C/N比。02常用的氮源

豆饼、花生饼、菜籽饼等；（三）无机盐

产酶培养基常需添加一定量的无机盐，主要有：P、S、K、Mg、Ca、Na盐等。在微生物发酵中，应特别注意有些金属离子是酶的组成成分，如钙离子是淀粉酶的成分之一，也是芽孢形成所必须的。2.2.3培养基的配制（四）生长因子

一般来源于玉米浆、麦芽汁、豆芽汁、酵母膏等。（五）pH值的调节

pH的变化常引起细胞生长和产酶环境的变化，对产酶带来不利的影响。在配制培养基时应根据微生物的需要调节pH。一般情况下，多数细菌和放线菌生长的最适pH为中性至微碱性，而霉菌和酵母则偏好微酸性。2.2.3培养基的配制生产中常采取调控pH的方法：01

添加缓冲液维持一定的pH；02

调节通风量维持发酵液的氧化还原电位在一定范围；03

调节培养基的原始pH，保持一定C/比；04

当发酵液pH过高时，用糖或淀粉来调节，pH过低时，通过调节。学习总结：1、酶的发酵生产概念2、微生物作为酶生产主要来源的原因3、微生物酶的发酵生产中培养基配制的要求。蛋白质工程的理论基础蛋白质工程的含义蛋白质工程的含义1、基本概念及实质

蛋白质工程就是在蛋白质的结构与功能为基础，利用基因工程的手段，按照人类自身的需要，定向地改造天然的蛋白质，甚至创造新的、自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子。蛋白质工程的实质是对编码蛋白质的基因进行改造。蛋白质的结构基础蛋白质的结构基础蛋白质的层次结构一级结构氨基酸序列α螺旋二级结构三级结构肽链的三维构象四级结构多亚基复合物β螺旋蛋白质工程的原理蛋白质的结构基础中心法则ReversetranscriptionSingle-strandedDNADNARNATranscriptionandreplcationNCproteinTranscriptionTranslactionDNAreplcation蛋白质的结构基础蛋白质的结构基础分子设计的层次｛基因水平的改造：改造蛋白质的编码基因蛋白质水平的改造：蛋白质的加工与修饰总结总结蛋白质工程的含义蛋白质的结构基础蛋白质工程的原理思考题生物体内蛋白质执行哪些生理功能？蛋白质工程的研究方法蛋白质工程的基本途径蛋白质工程的研究策略1.蛋白质工程的基本途径

从预期功能出发，设计期望的结构，合成目的基因且有效克隆表达或通过诱变、定向修饰和改造等一系列工序，合成新型优良蛋白质。蛋白质工程的主要研究手段

蛋白质工程的主要研究手段

蛋白质工程的研究策略策略1：对天然蛋白质进行改造。研究策略策略2：完全重建一个新的蛋白质。蛋白质的全新设计（1）设计目标的选择研究重点和难点从结构设计出发，从蛋白质的二级结构开始，以摸索蛋白质结构的稳定性。

蛋白质全新设计功能设计、结构设计。（2）蛋白质全新设计思路

是否存在蛋白质多聚体状态；二级结构与预期目标是否吻合。是否具有预定的三级结构。圆二色谱和核磁共振技术可用于研究蛋白质。是否以单分子或多聚体形式存在。三级结构测定目前主要依靠荧光和核磁共振技术。蛋白质的全新设计

天然的锌指多肽FSD-1多肽(从头设计)蛋白质的全新设计改变现有蛋白质的结构

分离纯化目标蛋白质。分析目标蛋白质的一级结构；分析目标蛋白质的三维结构以及结构与功能的关系。根据蛋白质的一级结构设计引物，克隆目的基因。根据蛋白质的三维结构和结构与功能的关系以及蛋白质改造的目的设计改造方案。对目的基因进行人工定点突变。改造后的基因在宿主细胞中表达。分离纯化表达的蛋白质并分析其功能，评价是否达到设计目的。维生素发酵生产我国用两步法发酵工艺生产维生素C。定点突变是目前蛋白质工程研究的主要技术手段。

基因人工定点突变改变蛋白质结构

M13载体法PCR扩增法蛋白质工程的研究策略(1）M13载体法

该法的原理是利用人工合成带突变位点的寡聚核苷酸作为引物，利用M13噬菌体载体系统合成突变基因。蛋白质工程的研究策略M13载体蛋白质工程的研究策略

M13载体法基因人工定点突变示意图（引自吴乃虎，1998）(2）ＰＣＲ扩增法

该法的原理也是利用人工合成带突变位点的诱变引物，通过ＰＣＲ扩增而获得定点突变的基因。PCR定点诱变法可分为重组PCR定点诱变法和大引物诱变法两种。一、深层发酵的操作方式蛋白质工程的研究策略

重组PCR定点突变法示意图（引自吴乃虎，1998）蛋白质工程的研究策略

重组PCR定点突变法示意图（引自吴乃虎，1998）蛋白质工程的应用实例概念

胰蛋白酶(EC3.4.21.4)是丝氨酸蛋白酶类，它是一条单链肽，由223个氨基酸残基组成，N末端为异亮氨酸。主要作用于精氨酸或赖氨酸羧基端的肽键。是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。胰蛋白酶极易自溶，自溶产物经层析分离后，会得到4个具有胰蛋白酶活性的片段。通过对N末端残基的分析，表明这些活性产物是由于Arg117-Val118、Lys145-Ser146及Lys159-Ala160处发生了断裂而出现的。人们运用字蛋白质工程手段,对Arg117位自溶点进行了缺失突变，最终得到了稳定性明显提高的突变株。一、胰蛋白酶二、金属硫蛋白

金属硫蛋白(metallotlnonein,MT)是由微生物和植物产生的金属结合蛋白，是一类富含半胱氨酸的短肽，是半胱氨酸残基和金属含量极高的蛋白质，可以通过半胱氨酸的巰基结合大量的金属素，对多种重金属有高度的亲和性。一般由两个大小相近，结构与功能类似的结构域组成,即a-结构域和β-结构域。人们为将含有a-结构域的基因转移到烟草中，成功的获得了对镉，铜,铅等重金属具有较高抗性的工程株。三、人白细胞介素-2

IL-2是第一个被发现的白细胞介素。天然人白细胞介素-2是一个由133个氨基酸残基组成的多肽，133个氨基酸中共有3个半胱氨酸，其中有一个半胱氨酸（Cys125）以游离方式存在，而另两个半胱氨酸（Cys58和Cys105）缩合成活性所必需的二硫键。

人们用蛋白质工程中的定位诱变技术将Cys125的密码TGT转换成TCT或GCA,使Cys125转换成丝氨酸或丙氨酸，避免了错误配对的产生。结果不但使IL-2的生物活性不受影响，而且其热稳定性等方面也得到了较明显的改善。工程IL-2目前已被美国FDA批准上市，用于治疗肾细胞瘤。我国卫生部也已经批准了在国内试生产基因工程白细胞介素-2。基因的概念及其结构

tPA能够切割纤溶酶原形成纤溶酶，从而激活纤溶作用(fibrinolysis)，使血栓溶解。作为一种高效特异性溶血栓药物。优点:（1）血栓选择性高但几乎不激活循环血液中的纤溶系统，可直接静脉注射；

（2）对中毒性休克引起的弥散性血管内凝血疗效显著等。利用基因定点诱变技术，改变tPA分子中的某些糖基化氨基酸而减少或避免了糖基化，有效地减缓了它在血浆中被清除的速率，达到了延长其半寿期的目的，临床应用价值得到有效提高。思考：蛋白质工程在枯草杆菌蛋白酶的应用实例？蛋白质组学简介目录蛋白质组研究的含义；蛋白质组学研究的内容；蛋白质组学研究工具；蛋白质组学的应用范围及前景蛋白质组学简介中心法则示意图一、蛋白质组研究的开端开端：

1.人类基因组序列草图的完成，宣告了“后基因组时代”的到来。2.人类基因组的所有基因及间隔序列已完全确定？3.基因组计划不能确定哪些基因在何时、何地、以何种程度表达；4.生物的基因组只表达部分基因(30~80%)；5.蛋白质是基因功能的执行体；6.以往的蛋白质研究难以系统透彻地阐释生命活动的基本机制；因此，无论是从基因组计划的局限、还是蛋白质研究的自身发展而言，大规模、全方位的蛋白质研究均是势在必行。蛋白质组：

一种细胞/组织/生物体某个时间段所包含的所有蛋白质的存在形式及其活动方式。二、蛋白质组及蛋白质组学的含义蛋白质组学：

研究蛋白质组的科学，阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式。研究内容01结构蛋白质组学三、蛋白质组学研究的内容

主要研究蛋白质的氨基酸序列、三维结构的解析、种类分析、数量确定等。02功能蛋白质组学

研究蛋白质的功能，确定蛋白质在亚细胞结构中的定位，蛋白质-蛋白质的相互作用等。四、蛋白质组学的工具工具：

1.数据库：蛋白质、EST（expressedsequencetags)、和基因组序列数据库2.质谱（MS）：质谱数据为蛋白质鉴定提供了最有力和最精确的方法。3.对数据库中特定蛋白质序列与质谱数据进行比对的各种软件。4.蛋白质的分析分离技术，聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-SDS）是最广泛用于蛋白质组学的技术。

EST(ExpressedSequenceTag)表达序列标签，表达序列标签是cDNA克隆的末端序列,平均长度为300～500bp,称为表达序列标签,通常是从已有的cDNA文库中随机取出几百到几千个克隆一次测序产生,一般使用载体多克隆位点互补序列作为通用引物。一个EST代表生物体某种组织在某一时期的一个表达基因。采用生物信息学方法延伸表达序列标签（ESTs）