病毒的培养技术（动物微生物课件）

一病毒的分类二病毒的特点三病毒的形态结构与化学组成

病毒的概念病毒的大小与形态四病毒的结构与化学组成五你对病毒的形态结构了解吗?3种病毒在电子显微镜放大数十万倍后再经计算机处理而得到的图象艾滋病病毒新冠病毒禽流感病毒各种形态病毒的电镜照片细菌过滤器电子显微镜病毒的发现烟草花叶病毒伊凡诺夫斯基，俄罗斯著名科学家，1892年发现烟草花叶病病源的滤过性100年前，科学家们在研究烟草花叶病的病因时，将患花叶病的烟草榨出汁液，通过细菌过滤器将细菌滤去，再用过滤后的汁液去感染正常的烟草，结果发现烟草仍然患病。于是，他们认为烟草花叶病是由一种比细菌还小的生物引起的，但人们仍然不认识它的“庐山真面目”，直到20世纪30年代，科学家发明了电子显微镜，才看到了它的真面目，并把这种生物叫做“滤过性病毒”，这就是我们所说的病毒。病毒（Virus）一、概念：病毒是一类体积微小、结构简单，只含一种类型核酸(RNA或DNA），必须在活的易感细胞内以复制的方式进行增殖的非细胞型微生物。完整成熟的具有感染性的病毒颗粒称病毒体，具有典型的病毒形态结构和传染性。烟草花叶病毒噬菌体禽流感病毒二、病毒的分类（按寄生宿主）：

1.植物病毒2.动物病毒3.细菌病毒1.植物病毒：专门寄生在植物细胞内烟草花叶病毒寄生于菜青虫的病毒2.动物病毒：寄生于无脊椎动物的细胞内的病毒寄生于脊椎动物和人体细胞内的病毒狂犬病毒-寄生于人、畜禽流感病毒-寄生于人、禽3.细菌病毒：寄生在细菌等生物细胞里的病毒，也叫噬菌体。1.个体微小以纳米（nm）为测量单位，可通过细菌滤器；必须在电子显微镜下放大几万至几十万倍后方可观察。细菌滤器病毒可以通过细菌滤器滤膜，而大于滤膜孔径的细菌等颗粒不能通过电子显微镜三、病毒的特点2.结构简单病毒无完整的细胞结构，仅含有一种类型核酸（RNA或DNA）。动物细胞：有完整的细胞结构（细胞核、细胞质、细胞膜)病毒：无完整的细胞结构(核酸)三、病毒的特点3.专性细胞内寄生病毒必须寄生在活细胞内，利用宿主的代谢系统和能量，以复制方式增殖，具有严格的宿主特异性。eg.新城疫病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，强毒株可使鸡群全群毁灭新城疫病毒三、病毒的特点4.对抗生素不敏感由于病毒无完整的细胞结构和代谢系统，对抗生素不敏感。干扰素可抑制病毒增殖。三、病毒的特点抗生素犬用干扰素病毒的大小差别悬殊(20～300nm),球型病毒用直径长短表示，其他形状病毒以长度*宽度表示。最大的痘病毒约300nm；最小的脊髓灰质炎病毒约20～30nm。四、病毒的大小与形态--1.病毒的大小病毒具有多形性，一般呈球形或杆形，少数为子弹形、砖形或蝌蚪形。例如：腺病毒、冠状病毒疱疹病毒为球形；烟草花叶病毒为杆形狂犬病毒为子弹形痘病毒为砖形噬菌体为蝌蚪形四、病毒的大小与形态--2.病毒的形态球形病毒杆形病毒蝌蚪形病毒人和动物病毒多为球形；植物病毒多数为杆形；细菌病毒多为蝌蚪形。五、病毒的结构与化学组成基本结构核衣壳

病毒体核心衣壳辅助结构包膜病毒粒子是指一个结构和功能完整的病毒颗粒。病毒粒子主要由核酸和蛋白质组成。核酸位于病毒粒子的中心，构成了它的核心，蛋白质包围在核心周围，构成了病毒粒子的衣壳。核酸和壳体合称为核衣壳。无包膜病毒或裸露病毒衣壳核酸包膜刺突包膜病毒裸露病毒包膜病毒包膜刺突最简单的病毒就是裸露的核衣壳，称为裸露病毒或无包膜病毒；某些病毒的核衣壳外，还有一层包膜结构，称为包膜病毒。

1.核心核酸组成各种病毒的核心。一种病毒只含有一种类型的核酸（DNA或RNA）；噬菌体大多含DNA，植物病毒大多数含RNA。核酸可以是单股的，也可以是双股的；可以是线状的，也可以是环状的。功能：病毒核酸（基因组）储存病毒的遗传信息，控制其遗传变异、增殖和对宿主的感染性等。核酸五、病毒的结构与化学组成2.衣壳指围绕病毒核酸并与之紧密相连的蛋白质外壳，它由许多壳粒组成。壳粒是指在电子显微镜下可以辨认的组成壳体的亚单位，由一个或多个多肽分子组成。衣壳功能：保护病毒核酸免受核酸酶的破坏；无包膜病毒体的衣壳蛋白可吸附于易感细胞表面，协助病毒侵入细胞引起感染；具有免疫原性，诱导产生免疫应答。核酸衣壳壳粒五、病毒的结构与化学组成衣壳类型：根据壳粒的排列方式不同，病毒的衣壳有3种对称型结构。①二十面体对称型②螺旋对称型③复合对称型螺旋对称型复合对称型二十面体对称型腺病毒①二十面体立体对称:外围的壳粒排列成二十面体对称型，外观为球状，实际为20面体。eg.腺病毒②螺旋对称:衣壳粒一个接一个地呈螺旋对称排列而成，核酸存在于螺旋状沟中。eg.烟草花叶病毒核酸蛋白质衣壳烟草花叶病毒

③复合对称：头部呈球形，为20二十面体立体对称，尾部是一管状结构，为螺旋对称。eg.大肠杆菌T系噬菌体（蝌蚪形）20面体立体对称型螺旋对称型核心(黄色部分)衣壳(棕色\绿色部分)噬菌体（电镜）3.包膜部分病毒的衣壳外还包绕的一层囊膜样结构，称为包膜。包膜组成：由宿主细胞膜或核膜（双层脂质）组成，镶嵌有糖蛋白组成的丁状突起，即刺突。包膜包膜子粒或刺突五、病毒的结构与化学组成3.包膜包膜具有双重性：①宿主细胞膜性：病毒从细胞内向外释放而获得宿主细胞膜或核膜成分(脂质)。②病毒蛋白特性：包膜的蛋白质由病毒基因编码，常位于病毒体的表面，构成剌突。3.包膜有包膜的病毒称为包膜病毒。例如：新城疫病毒、冠状病毒3.包膜包膜功能：①保护核衣壳；②与病毒的吸附、亲嗜性有关；eg.冠状病毒通过包膜上的特殊结构识别并附着于黏膜细胞③包膜刺突具有免疫原性。病毒的鸡胚接种病毒培养的宿主：本动物（例如：猪瘟病毒-猪）实验动物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、鸡胚体外培养的活细胞在本试验中，采用的是鸡胚接种、培养新城疫病毒。一、实验目的

了解鸡胚的基本结构与功能；

掌握新城疫病毒的鸡胚尿囊腔接种法。

二、试验原理

鸡胚为活的动物机体，组织分化程度低，病毒易于增殖，可选择不同的日龄和接种途径，感染病毒的组织和液体中含大量病毒。

尿囊腔接种常用于流感病毒、新城疫病毒等的接种和培养。进入尿囊腔的这些病毒，能够在尿囊的内胚层细胞中大量繁殖，随后释放到尿囊液中。通过尿囊腔接种途径可获得大量的病毒。二、试验原理

鸡胚为活的动物机体，组织分化程度低，病毒易于增殖，可选择不同的日龄和接种途径，感染病毒的组织和液体中含大量病毒。

尿囊腔接种常用于流感病毒、新城疫病毒等的接种和培养。进入尿囊腔的这些病毒，能够在尿囊的内胚层细胞中大量繁殖，随后释放到尿囊液中。通过尿囊腔接种途径可获得大量的病毒。

三、材料

鸡新城疫病毒（NDV）、鸡胚（9-11日龄）、照蛋灯、蛋座、酒精棉球、碘酊棉球、酒精灯、打孔器、1mL注射器、石蜡、废物缸、孵卵箱四、鸡胚的结构与功能卵壳上有细孔，进行气体交换壳膜使气体分子和液体分子在内外两方面进行交换。气室呼吸和调节压力绒毛尿囊膜起胚胎呼吸器官的功能，氧气的交换是在膜的血管内通过卵壳孔而进行的。尿囊腔胚胎的排泄器官，内含有尿囊液，初为透明液体，以后尿囊液中尿酸盐迅速增加，胚胎发育到第12-13天后，尿囊液开始变得混浊。在本试验中，病毒的鸡胚接种部位在尿囊腔。羊膜与羊膜腔其中盛有羊水，胎体浸泡于其中卵黄在胚胎发育早期供给鸡胚营养。卵白在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。10日龄鸡胚的结构五、受精卵的选择最好是来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响。受精卵的壳最好是白色的。受精卵必须新鲜，保存在5-20℃不要超过10天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。六、鸡胚孵育条件孵卵箱内的温度应保持在37.5-38.5℃相对湿度：50%-60%必须保证具有充分的新鲜空气流通，特别是在孵化5-6天以后。从孵育后第3天开始，每天翻蛋一次。七、鸡胚生长发育过程鸡胚从第1天开始孵育至第21天出壳，胚胎发育过程如图所示。孵育至第13天时，鸡胚开始长毛。在本试验中，使用的是9-11日龄的鸡胚。在发育的早期，鸡胚不易辨认，要到4－5天后才容易看见。因此，检卵要在孵育4－5天后进行，每天用照蛋灯检卵一次，检查鸡胚的存活情况。活胚：活的鸡胚绒毛尿囊膜界线较明显，上面的血管清晰可见、成网状，可看到明显的胚胎自主运动。死胚：血管模糊、变细、折断脱落，成淤血带或淤血块，没有胚动。八、照蛋检卵发育至第5天的鸡胚发育至第4天的鸡胚活胚：血管清晰九、鸡胚尿囊腔接种新城疫病毒操作步骤1、选用9-11日龄的鸡胚，在黑暗环境下用照蛋灯检查鸡胚活力。活胚：发育良好的鸡胚可见清晰的血管和鸡胚暗影，较大鸡胚还可见到胚动。死胚：血管昏暗模糊成淤血带或淤血块，没有胚动。

2、在照蛋灯的灯光下用铅笔画出气室范围，并在将要接种的部位做好记号。注意：接种部位须避开大血管，在气室边缘靠上方0.5cm左右位置。

图中黑色部分即尿囊腔，注射器针头从接种部位垂直插入尿囊腔内，注入病毒液。九、鸡胚尿囊腔接种新城疫病毒操作步骤3、用酒精棉擦拭蛋胚，置于消过毒的蛋托上。4、用碘伏和酒精消毒接种和气室部位。先用碘伏棉球消毒，1min后用酒精棉球消毒。5、将打孔器灼烧灭菌，稍冷后在接种部位打一小孔。注意：打孔器打孔时不能穿透蛋壳膜，避免造成污染。6、将装有新城疫病毒液的注射器沿小孔插入针头的三分之二左右，注入0.2ml病毒接种物。7、用石蜡封口，并置孵卵箱中孵育（温度37℃，相对湿度50%-60%）。8、每天翻卵并检卵一次，24h内死亡者废弃；24h之后死亡的鸡胚标记好死亡时间，如48h、64h、72h。将死亡的鸡胚置于4℃冰箱过夜，待收毒。1.用于病毒培养的系统主要有哪些？2.简要说明鸡胚的结构及各部分结构的功能。3.如何区分死胚、活胚？4.用鸡胚来进行病毒的培养要注意哪些问题?作业一、实验目的

掌握鸡胚收毒方法。

掌握鸡胚收毒注意事项。

二、材料

已经接种病毒的SPF鸡胚；

灭菌好的组织镊、眼科镊、眼科剪、带盖小青瓶、枪头（蓝色）；

移液枪（ml）、酒精灯、碘伏棉球、酒精棉球、蛋托、废物缸，标签纸鸡胚收毒三、新城疫病毒接种鸡胚后对鸡胚的影响新城疫病毒通过尿囊腔接种法接种于9-11日龄鸡胚之后，若接种的新城疫病毒是强毒株，鸡胚在接种后30-60h死亡；若接种的是弱毒株，鸡胚在接种后3-6d死亡。以尿囊液含毒量最高，胚胎全身出血，以头部、足趾、翅膀出血最为明显。四、收毒前鸡胚处理--鸡胚冷置收获前鸡胚须气室朝上置于4℃冰箱6h或过夜，但不能放置时间过长（过长会引起散黄）。如急于收获亦可置-20℃冰箱1h左右。预冷的目的：将鸡胚冻死，使血液凝固，防止收毒过程中出血。注意：收毒时若有出血，会导致红细胞与尿囊液中的病毒发生凝集反应，造成病毒滴度下降。1.鸡胚消毒用酒精棉擦拭蛋胚，将鸡胚钝端向上置于消过毒的蛋托上。将鸡胚气室上方卵壳先用碘伏消毒，再用酒精棉脱碘。五、收毒操作步骤2.去除气室上方蛋壳首先用大镊子将消毒好的鸡胚气室一侧的蛋壳敲破，用眼科剪沿着气室边缘减除蛋壳，注意不要戳破蛋壳膜，