HYT 177-2014 海水中硫酸盐还原菌的测定 MPN法

海水中硫酸盐还原菌的测定MPN法Determinationofsulfate-reduci发布I本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家海洋局天津海水淡化与综合利用研究所提出。本标准由全国海洋标准化技术委员会(SAC/TC283)归口。本标准由国家海洋局天津海水淡化与综合利用研究所、浙江国华浙能发电有限公司负责起草。1海水中硫酸盐还原菌的测定MPN法1范围本标准规定了海水中硫酸盐还原菌的MPN测定方法。本标准适用于海水及海水利用浓海水中硫酸盐还原菌的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T16310.1—1996船舶散装运输液体化学品危害性评价规范水生生物急性毒性试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。硫酸盐还原菌sulfate-reducing一类在无氧或缺氧状态下，能将水中可溶性的硫酸盐还原为硫化氢的细菌。应用多管发酵技术，采用概率理论估算细菌浓度的方法。取自未污染海域，装入玻璃瓶后储放在暗处15d以上的海水。4方法原理本方法采用多管发酵技术，在(29±1)℃培养21d,如果试管底部产生黑色硫化铁沉淀并伴有硫化氢臭味的，表明阳性反应，采用MPN法对被测试样中的硫酸盐还原菌进行计数。5试剂与材料本试验方法中，除特殊规定外，应使用分析纯试剂和符合GB/T6682中三级水规格的水。试验所需试剂与材料如下：a)磷酸氢二钾；b)无水氯化钙；2e)硫酸钠；f)酵母汁；h)硫酸亚铁铵；i)半胱氨酸；k)陈海水；I)人工海水：按GB/T16310.1—1996配制；n)盐酸溶液：1+11;o)牛皮纸，6仪器与设备6.1无菌箱(室)或超净工作台。6.2蒸汽压力灭菌器。6.4电热干燥箱：温度控制范围60℃~280℃,允差±2℃。6.5电热恒温水浴锅：恒温范围37℃~100℃,允差±1℃。6.6天平：称量范围0g～220g,感量0.01g。6.8振荡器。6.12烧杯：1000mL。6.13无菌试管：直径18mm,长度180mm,配硅胶塞。6.14无菌试管：直径15mm,长度150mm,配橡胶塞。6.15无菌刻度吸管或移液器和Tip头。6.16无菌采样瓶：广口玻璃瓶或聚丙烯(PP)塑料瓶。7试验前准备将水分装在2个150mL磨口三角瓶(6.11)中，每瓶40mL,每个三角瓶塞子和瓶口间插入一小纸片来防止粘连，瓶口均用牛皮纸包扎，用蒸汽压力灭菌器(121±1)℃灭菌20min,冷却后备用。3成分如下(每升中的含量):a)磷酸氢二钾b)无水氯化钙c)氯化铵d)硫酸镁e)硫酸钠h)硫酸亚铁铵i)半胱氨酸7.2.2.1将7.2.1a)～g)试剂溶解到500mL海水和500mL蒸馏水配制的混合水中，用氢氧化钠溶液(160g/L)或盐酸溶液(1+11)调节pH至7.2±0.2,并分装于三角瓶(6.11)中，用蒸汽压力灭菌器(121±1)℃灭菌20min,冷却后备用。7.2.2.2硫酸亚铁铵溶液：在培养基使用的当天，称取1.2g硫酸亚铁铵，在无菌箱(室)(6.1)内均匀地摊放在离紫外线灯的垂直距离30cm处灭菌30min,在无菌操作下，把硫酸亚铁铵溶解于事先准备好7.2.2.3半胱氨酸溶液：在培养基使用的当天，称取0.6g半胱氨酸，在无菌箱(室)(6.1)内均匀地摊放在离紫外线灯的垂直距离30cm处灭菌30min。在无菌操作下，把半胱氨酸溶解于事先准备好的7.2.2.4在无菌操作下，按每100mL培养基(7.2.2.1)分别加入1.0mL硫酸亚铁铵溶液(7.2.2.2)和将陈海水或人工海水分装在试管(6.13)中，每管9mL,用蒸汽压力灭菌器(121±1)℃灭菌20min,将硫代硫酸钠放在无菌箱(室)(6.1)内，并均匀地摊放在离紫外线灯的垂直距离30cm处灭菌8分析检测8.1.1用灭菌采样瓶(6.16)采集被测样品，在取样过程中，要保护瓶口和颈部，防止这些部位受杂菌污8.1.2若采集的水中有余氯，或在不能判断水中是否有余氯的情况下，应在采样前，在无菌操作下，于灭菌采样瓶(6.16)中加入灭菌的硫代硫酸钠(7.4),加入量为每升水样约0.1g。若确定水样不含余氯，4则无需加入硫代硫酸钠(7.4)。8.1.3水样采集后，应立即进行测定，如果在2h内不能进行测定，应把水样放在冰箱中冷藏保存，存放时间不宜超过24h。经冷藏保存后的水样需测定时，从冰箱中取出，在生化培养箱(6.3)中(29±1)℃活化4h～5h,再进行测定。8.2水样的稀释和接种8.2.1按10倍稀释法对水样进行系列稀释，应使最后一个稀释度接种培养后无硫酸盐还原菌生长。8.2.2将不同稀释度的水样分别接种到无菌试管(6.14)中，每个稀释度重复接种3～5管，每管接种1mL,每接种一个稀释度更换一支无菌吸管或Tip头(6.15)。测定一个水样从接种到灌入培养基不得超过20min。8.2.3另取一组无菌试管(6.14),接种1mL无菌稀释水作为空白对照。8.2.4将无菌培养基放入电热恒温水浴锅(6.5)中，加热至60℃,取出冷却至室温后灌满试管(8.2.2和8.2.3),盖上密封胶塞。在生化培养箱(6.3)中，于(29±1)℃培养21d。9计数与报告9.1如果试管中产生黑色沉淀并伴有硫化氢臭味的表示有硫酸盐还原菌存在，以“+”(阳性)表示，否9.2如果空白对照出现阳性反应，表明测定过程中有污染，本次测定无效。9.3数出10进位稀释管中阳性试管数，以阳性组合指数记录下来。9.4在10进位稀释中多于三个稀释度时，阳性组合的指数只需要用其中依次的三个稀释度，以每个稀释度接种5管为例，对这三个稀释度的决定是先选5管全部阳性反应的最大稀释度，然后选出与其相连的两个更高的稀释度，算出阳性组合指数(见表1例1、例2、例4)。9.5若按照9.4所规定的原则选出三个稀释度后，有更高的稀释度仍然产生一个阳性试管时，就应该将这一个阳性试管并入所选择的最高稀释度的阳性结果中(见表1例3)。9.6根据阳性组合的指数，查附录A得出最大可能菌数，除以阳性组合指数的第一位数字的稀释度数，即为每毫升水样中硫酸盐还原菌的菌数(如果每个稀释度重复接种4管或3管，根据阳性组合的指数查附录B或附录C)。9.7报告方式见表1。表1计数与报告方式阳性组(个/mL)1552002542005表1(续)阳性组(个/mL)3十—一3110455506(规范性附录)五个平