分子生物学实验

分子生物学实验日常要求上课时间：上午8:00-下午5:00，提前5分钟进入实验室迟到、早退每次扣3分，无故旷课每次扣10分，累计3次没成绩请假须医院病假条或班主任签字的假条上课时需穿实验服，不许在实验室内吃东西实验课期间不许打闹、闲聊等，保持课堂纪律随时保持实验台的整洁认真作好值日工作，离开实验室须向教师声明必须做到课前认真预习，课间做好实验记录、课后详细总结实验结果并按时提交实验报告严格遵守实验室的各种规章制度爱护实验器材实验器材损坏必须按规定赔偿用完仪器后必须复位注意门窗水电的安全在实验过程中一定要保持实验台面、地面、实验仪器有序、整洁和卫生每位同学负责自己实验台面和柜体的卫生，值日生负责公用实验台、地面等处卫生同学与老师之间、同学与同学之间、实验班与实验班之间一定要互相协作配合保持公用房间卫生实验成绩平时成绩60分实验技能20分实验报告20分实验态度10分实验室常识10分实验设计及实施40分设计报告20分实验实施10分结果及分析10分参考书基因工程原理（第二版）吴乃虎编著科学出版社分子克隆实验指南（第三版）黄培堂等译科学出版社基因克隆和DNA分析魏群等译高等教育出版社最新分子生物学实验技术梁国栋主编科学出版社实验内溶绪论—分子生物学实验的诞生和发展分子生物学实验的基本知识简介实验规范训练、实验准备大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化PCR基因扩增及扩增产物的回收(核酸的回收)琼脂糖凝胶电泳质粒DNA的提取及其定性定量分析核酸的定量DNA重组－酶切连接、转化、筛选外源基因在大肠杆菌中的诱导表达及检测免疫印迹哺乳动物基因组DNA的提取及其定性定量分析植物总RNA的提取及其定性定量分析演示：Southern、DNA序列测定、RT－PCR及mRNA差异显示设计实验及其实施实验安排实验周实验内容1绪论—分子生物学实验的诞生和发展分子生物学实验基本知识简介

2分子生物学实验室常用仪器设备及其使用实验规范训练及实验准备

3大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化4质粒DNA的提取及其定性定量分析5PCR基因扩增及扩增产物的回收（DNA的回收）6DNA重组（限制性酶切和连接）哺乳动物基因组DNA的分离及其定性定量分析7大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化哺乳动物基因组DNA的分离及其定性定量分析8重组子的筛选（蓝白筛选、比较重组子的大小和酶切片段分析）9外源基因在大肠杆菌中的诱导表达、设计实验讨论10植物总RNA的提取及其定性定量分析11蛋白质印迹、设计实验准备12设计实验13设计实验、Southern（演示）14设计实验、DNA序列测定（演示）15设计实验、RT-PCR16设计实验设计实验一:原核生物的酶的克隆和原核表达限定目标：目的基因－原核生物的酶、表达载体－pET21a或pETBlue－2限制性内切酶：BamHⅠ和HindⅢ要求：找到具体某一原核生物的某一编码基因的全序列利用分析件进行目的基因内部限制性内切酶的酶切分析及5’和3’末端引物的设计提交具体的实验方案（从提取全基因组到目的基因的重组、表达及活性分析）第八个实验周前必须把详细的实验设计交给指导教师第八个实验周指导教师组织全班同学讨论每个实验设计，确定两个最好的实验设计在全班进行具体的实验实践设计实验二:小麦看家基因的克隆限定目标：小麦看家基因、表达载体－pET21a或pETBlue－2限制性内切酶：BamHⅠ和HindⅢ材料：培养10天左右的小麦要求：找到小麦的具体某一看家基因（最好是酶）的基因提交具体的实验方案（从材料准备到看家蛋白的克隆）第八个实验周前必须把详细的实验设计交给指导教师第八个实验周指导教师组织全班同学讨论每个实验设计，确定一到两个最好的实验设计在全班进行具体的实验实践设计实验三:大肠杆菌K12碱性磷酸酶的定点突变限定目标：大肠杆菌K12碱性磷酸酶的功能位点的突变表达载体－pET21a或pETBlue－2、限制性内切酶：BamHⅠ和HindⅢ材料：大肠杆菌K12碱性磷酸酶要求：找到碱性磷酸酶的功能位点，用PCR的方法进行定点突变。提交具体的实验方案，第八个实验周前必须把详细的实验设计交给指导教师。第八个实验周指导教师组织全班同学讨论每个实验设计，确定一到两个最好的实验设计在全班进行具体的实验实践。设计实验四:荷瘤小鼠的mRNA差异显示限定目标：找到正常小鼠和荷瘤小鼠中有差异的mRNA材料：小白鼠、H22腹水瘤细胞要求：提交具体的实验方案（从材料准备到mRNA的差异显示）；第八个实验周前必须把详细的实验设计交给指导教师；第八个实验周指导教师组织全班同学讨论每个实验设计，确定一到两个最好的实验设计在全班进行具体的实验实践。绪论—分子生物学实验的诞生和发展1952J.WatsonandF.Crick1953DNADoubleHelixmodel

分子生物学的重要里程碑TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1962"fortheirdiscoveriesconcerningthemolecularstructureofnucleicacidsanditssignificanceforinformationtransferinlivingmaterial"FrancisHarryJamesDeweyMauriceHughComptonCrick

WatsonFrederick

Wilkins

1965年发现限制性核酸内切酶TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1978,"forthediscoveryofrestrictionenzymesandtheirapplicationtoproblemsofmoleculargenetics“1973年斯坦福大学Cohn和加州大学Boyer：重组DNA技术

WernerArberDanielNathansHamiltonO.SmithPaulBerg

WalterGilbert

FrederickSanger

"fortheircontributionsconcerningthedeterminationofbasesequencesinnucleicacids“

1977

DNAsequencingTheNobelPrizeinChemistry1980"forhisfundamentalstudiesofthebiochemistryofnucleicacids,withparticularregardtorecombinant-DNA"

"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method“

KaryB.MullisMichaelSmith

"forhisfundamentalcontributionstotheestablishmentofoligonucleotide-based,site-directedmutagenesisanditsdevelopmentforproteinstudies"TheNobelPrizeinChemistry19931997年2月苏格兰Wilmut

绵羊“多利”的克隆，为发育生物学研究开拓了更广阔的空间2000年6月HGP提前完成,功能基因组时代到来分子生物学中的两项最重要的实验技术

分子生物学的诞生和发展中的瓶颈基因克隆（DNA重组，基因工程）

Geneclone,DNArecombination,geneengineering

基因转移载体的发现vectorDNA操作工具酶的发现DNAmanipulation

基因合成和基因测序sequencePCR技术

polymerasechainreaction开设分子生物学实验课程的历史沿革和重要性

基因工程带来的革命及在我国的反响生物化学的发展分子生物学成为现代生命科学的“共同语言”和深入研究的工具遗传学、发育生物学微生物学、细胞生物学神经生物学、分子免疫学分子药理学、分子病理学分子分类学、分子生态学农林、畜牧等分子生物学实验课程的内容及应用举例

广义的分子生物学技术基因克隆、PCR及一系列技术从活细胞中提取DNA、RNA的基本技术基因操作技术电泳技术感受态细胞及转化技术重组子的筛选和鉴定技术DNA测序技术印迹和杂交技术核酸定量外源基因在大肠杆菌中的诱导表达等基因表达及基因工程药物、基因工程疫苗基因鉴定的几种方法及人类疾病基因的鉴定Southern（DNA)印迹Northern(RNA)印迹Western(蛋白）印迹PCR基因扩增逆转录PCR(RT-PCR)人类疾病基因的鉴定基因突变及生物大分子结构功能的研究

二十一世纪生物学的新热点及领域结构生物学（StructuralBiology）生物大分子的高级三维结构与功能的统一生物大分子之间的互作→基因的社会学分子发育生物学（MolecularDevelopingBiology）基因表达，基因互作

器官发生胚胎形成个体发育21世纪生命科学发展的重要态势对生命现象的认识从单基因水平向全基因组整体水平发展现代生命科学研究的理论与技术从较长期的积累走向应用分子生物学实验的基本知识简介基因工程又称DNA重组技术外源基因通过体外重组后，导入受体细胞内，使这个基因能够在受体细胞内复制、转录、翻译、表达的操作包括基因的分离、重组、转移、基因在受体细胞内的保持、转录、翻译表达等全过程有人也将其它使细胞基因组结构得到改造的体系也包括在基因工程内以区别于DNA重组基因工程四要素：目的基因、工具酶、载体、受体细胞

工具酶

限制性内切酶 连接酶 聚合酶逆转录酶 激酶和磷酸酶 核酸外切酶和核酸内切酶

DNA酶和RNA酶 甲基化酶 拓扑异构酶 蛋白思考题这些工具酶的结构特点和功能是什么？2.它们在分子生物实验中各有什么用途？工具酶—限制性内切酶特异地识别和结合于一段特殊的DNA序列（二元对称）多数限制性内切酶识别长度为4-6个核苷酸，少数识别更长的核苷酸序列切割双链DNA切割后形成平端或粘端

BamHⅠ

↓

5’NNGGATCCNN3’3’NNCCTAGGNN5’

↑

5’NNGGOH

pATCCNN3’3’NNCCTApHOGGNN5’HindⅢ

↓

5’AAGCTT3’3’TTCGAA5’↑↓

+注：不同的酶、不同厂家生产的同一种酶的消化条件不同，没有经验时参阅说明书星号酶活力限制酶识别位点与大肠杆菌dam、dcm甲基化作用位点重叠时

dam:表示限制性酶切时dam甲基化作用抑制

dcm:表示限制性酶切时dcm甲基化作用抑制

(－):表示以上两种甲基化作用均无影响

(？):表示甲基化的影响未见报道许多限制性内切酶在离开识别序列一段距离的地方切割，其切割位点用括号内的数字来表示。如：HgaIGACGC(5/10)切割消化条件不利于碱基间形成氢键而连接则相反工具酶—连接酶粘端、平端DNA或切口的连接：T4噬菌体DNA连接酶5’pApCpGoH

pApApTpTpCpGpT3’3’TpGpCpTpTpApAp

oHG

pCpAp5’Mg2+ATP

↓T4DNA连接酶5’pApCpGpApApTpTpCpGpT3’3’TpGpCpTpTpApApGpCpAp5’单链DNA或RNA的连接：T4噬菌体RNA连接酶热稳定DNA连接酶DNA聚合酶DNA聚合酶I(全酶）5’-3’DNA聚合酶活性3’-5’外切酶、5’-3’外切酶切口平移法标记3’末端标记Klenow片段5’-3’DNA聚合酶活性3’-5’外切酶末端补平、末端标记cDNA第二链的合成T4噬菌体DNA聚合酶外切核酸酶活性比Klenow片段活性高200倍体外诱变、末端标记T7噬菌体DNA聚合酶5’-3’DNA聚合酶活性3’-5’外切酶体外诱变、末端标记热稳定DNA聚合酶聚合酶活性、5’-3’外切酶PCR、DNA序列测定

反转录酶以RNA为模板合成DNAcDNA的合成依赖于DNA的RNA聚合酶以DNA为模板合成RNA合成单链RNA做探针末端转移酶在2价阳离子存在时催化dNTP加于DNA分子的3’羟基端cDNA末端加同聚尾末端标记激酶和碱性磷酸酶

T4噬菌体多核苷酸激酶[r-32p]ATP二硫苏糖醇Mg2+DNAOH5’或RNAOH5’5’[32p]DNA或5’[32p]RNAADP+

32P标记DNA5’末端，磷酸化5’末端5’pDNA5’pRNA5’OHDNA5’OHRNA碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶(BAP)，牛小肠碱性磷酸酶(CIP)32P标记前去除5’磷酸，去除DNA片断5’磷酸防止自身环化载体自我复制、筛选标记具有合适的限制酶切位点高拷贝数、小分子量、高稳定性质粒载体：pUC19、pET21a、pETBlue－2噬菌体载体：λ噬菌体载体

M13噬菌体载体病毒：pCAT3人工染色体：克隆载体{

表达载体{原核真核思考题载体的特点？2.都有哪些载体？3.每种载体在分子生物实验中的功能是什么？4.载体和宿主细胞之间的关系是什么？5.如何选择合适的载体？T7promoter311-327T7transcriptionstart310T7•Tagcodingsequence207-239Multiplecloningsites(BamHI-Xho

I)158-203His•Tagcodingsequence140-157T7terminator26-72lacI

codingsequence714-1793pBR322origin3227bla

codingsequence3988-4845f1origin4977-5432lac

operator3606–3625T7promoter1–17lac

operator22–42T7transcriptionstart18multiplecloningregion276–467(Nco

I–PacI)His•Tag®codingsequence437–454HSV•Tag®codingsequence395–430lacZ

startcodon491lacZ

α-peptideORF57–491E.colipromoter541–569f1origin1096–1551bla

codingsequence1669–2526pUCorigin3206受体细胞受体细胞为外源基因的克隆和表达提供特定的环境和条件载体体系一定要与受体细胞的基因型相配如：利用α互补筛选的载体要选择ф80lacZ△M15基因型的受体细胞才能实现α互补筛选思考题1.受体细胞的特点什么？2.都有哪些受体细胞？3.载体和受体（宿主）细胞之间的关系是什么？4.如何选择合适的受体细胞？JM109菌株可作为大多数质粒载体的受体菌，也可以用于制备M13等噬菌体载体的单链DNA。该菌株易于培养，并且可以用较多的转化方法进行有效的转化。DH5α菌株一种常用于质粒克隆的菌株。其j80lacZ△M15基因的产物可与pUC载体编码的b-半乳糖苷酶氨基端实现a互补，可用于蓝白斑筛选。recA1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。BL21（DE3）菌株该菌株用于以T7RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表达。BL21（DE3）pLysS菌株该菌株带有质粒pLysS，具有氯霉素抗性。此质粒含有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。目的基因的来源和分离基因组文库：基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体

cDNA文库：将真核细胞内全部mRNA转录成cDNA并将双链cDNA和载体连接，由此得到的cDNA克隆群体直接从特定的mRNA入手PCR和RT-PCR基因的化学合成从蛋白质入手思考题1.为什么需要目的基因？2.如何鉴定目的基因？3.如何获得目的基因？外源基因导入受体细胞CaCl2处理后的细菌转化或转染高压电穿孔聚乙二醇介导的原生质体转化原生质体融合细胞核的显微注射颗粒轰击技术重组子的筛选1. 根据重组载体的特点进行筛选：抗药性筛选法、插入失活2. 营养缺陷型筛选法：载体上携带某些营养成分基因而受体菌缺失3. 限制性酶切分析4. 核酸杂交：原位杂交、Southern、Northern5. PCR表达产物的检测：电泳、测活、蛋白印迹序列测定分子生物学实验室常用仪器设备样品、试剂和材料等的保存温度控制系统--冰箱：40C、-200C、-700C恒温培养箱细菌平板的培养恒温空气摇床

菌体的培养灭菌器培养基、试剂、耗材等的灭菌PCR仪PCR扩增、保温实验等恒温水浴及微量加热器保证实验温度的恒定电泳槽核酸或蛋白质的电泳定性分析时的凝胶支架电泳仪电泳时提供电压和电流凝胶成像系统

电泳结果的定性和定量分析台式高速冷冻离心机样品的分离落地式高速冷冻离心机样品的分离分光光度计样品的定量测定超净工作台

提供洁净工作环境电子天平样品、试剂等的称量pH计

精确的pH值测定移液器

液体试剂的精确取量实验规范训练－仪器的操作要求：仪器在未经培训前，不得擅自使用严格按操作规程使用仪器，有些仪器必须有教师在场时才能使用，并由教师操作违反规定的使用者，造成的后果由使用者承担实验规范训练－量程的选择天平烧杯、量筒、容量瓶、试剂瓶－－不同规格量程的选择－移液器实验规范训练－标签所用的器皿上一定要做标记标签一定要贴到固定的位置标签上应包括具体的名称、组别、实验班、日期实验规范－实验操作详细记录和分析实验结果并按时提交实验报告实验中一定要处处用心、勤动手，多问为什么仔细操作和观察保留好每一步的实验样品，在确准的情况下才能当废液扔掉实验准备清点和熟悉常用玻璃器皿、耗材等洗涤本学期实验用玻璃器皿配试剂1.0.1mol/LCaCl2100mL2.5mol/LNaOH100mL

胶塞3.LB液体培养基100mL

胰蛋白胨（typtone)1g

酵母提取物（yeastextract)0.5g

NaCl1g

加部分水溶解后加20μL5mol/LNaOH，定容到70mL（40mL到两个250mL锥形瓶，3mL分别到大试管中，用于预培养及复苏）4.10%(w/v)SDS储液50mL

，室温保存5.1mol/L

Tris200mL6.2mol/LHCL100mL7.0.5mol/LEDTA100mL80mL水中加18.61gEDTA-Na2H2O，用NaOH调pH8（约需2gNaOH），后定容至100mL8.5xTBE1000mL9.75%乙醇500mL10.Amp：50mg/mL20ml，分装每管1mL，－200C保存注意：先将所需烧杯、量筒、玻棒、双蒸水、小指管灭菌待温度降到室温后，在超净台中配制，再用一次性滤器过滤分装于1.5mL无菌小指管中，用封口膜封口于－200C保存高温灭菌1.LB液体培养基2.50mL离心管2个/组3.枪头/2组：5mL6支，1mL1盒，200uL1盒4.培养皿6套/组5.1.5mL50个/2组6.无菌水100mL/班7.0.1mol/LCaCl28.烧杯、量筒、玻棒、小指管（配Amp组准备）明天上午7:45收灭菌的东西及平板，下周三下午接菌预培养大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化

时间安排时间实验内容8:00-8:30接菌8:40-10:30培养2.5－3小时、讲解本实验的基本原理及相关知识10:30-11:30培养2.5－3小时、配试剂、灭菌、准备下次实验11:30-12:30午饭12:30-14:00感受态细胞的制备14:00-15:00转化15:00-17:00复苏、铺Amp抗性平板、复苏细胞涂平板受体菌：E.ColiDH5αR-,M-,Amps,Tcs外源质粒:Puc18/19Ampr抗性基因编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力基本原理感受态（Competence)：细菌处于容易吸收外源DNA的状态转化（transformation)：异源DNA分子导入受体细胞的过程致敏过程:用理化方法诱导细胞进入感受态的操作细菌处于00C,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外援DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面,经短时间420C热激处理,促进细胞吸收DNA复合物复苏：细菌在非选择性培养基上保温一段时间，使抗性的表型表达后再转到含抗性的选择性培养基上，长出来的菌落即为转入了外源基因的菌落转化的确切机制还不清楚实验流程感受态细胞的制备：1.预培养：接一单菌落到3mLLB培养基中，370C、190rpm振荡培养过夜2.取0.4mL预培养菌液转移到含40mLLB液体培养基的锥形瓶中，370C、250rpm振荡培养2.5-3小时（OD6000.4-0.5）3.将菌液转移到50mL离心管中，冰上放置10min4.离心6000rpm，40C，10min5.到出培养液，将管倒置使培养液流尽6.菌体加入预冷的0.1mol/L的CaCl210mL，轻吹并悬浮细胞，冰上30min7.离心6000rpm，40C，10min，去上清8.用冰预冷的0.1M的CaCl22mL用枪轻吹悬浮细胞，冰上操作9.分装细胞，200uL/份，此为感受态细胞（可于-700C或-200C冻存）转化及复苏1.取200uL感受态细胞，加入DNA(PUC19)2uL（50ng)

取200uL感受态细胞，加入2uL无菌水（阴性对照1）取200uL0.1mol/L的CaCl2，加入DNA(PUC19)2uL（50ng)

（阴性对照2）用枪头混匀，冰上放置30min阴性对照的目的？2.420C循环水浴热激90秒3.冰浴2分钟4.每管加800uLLB液体培养基，370C慢摇1小时（150rpm）5.100uL或50uL已复苏的感受态细胞，涂布在含Amp的培养皿中6.倒置培养过夜（370C）影响转化效率的因素细菌的生长状态(5x107个/mL)感受态细胞的质量试剂的质量外源DNA的质量与数量器皿的洁净度污染—尽量所有打开器皿盖的操作都在超净台中进行思考题如阴性对照中长出菌，原因？在Amp培养板中，菌的密度过高或培养时间过长时会在阳性菌的周围长出一些小的卫星菌落，它们是Amps的，原因？配试剂1.LB固体培养基100mL

灭菌后待温度降到600C左右，加入Amp，立即铺平板2.溶液I50mL

分成四份3.溶液III50mL

分成四份4.TE50mL

灭菌后分装于小管中-200C冰箱保存5.氯仿:异戊醇＝24:1300mL

分成四份（棕色瓶）6.酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1200mL

棕色瓶分成四份（棕色瓶）（注：试剂2－6为下一个实验的试剂，本周准备）灭菌1.LB固体培养基2.溶液I，溶III3.TE4.小指管：1.5mL

、2mL

各40个/2组，0.5mL20/2组5.枪头：200uL、1mL各1盒/2组明天上午7:45收灭菌的东西及平板，下周三下午接菌预培养质粒DNA的提取及其定性定量分析

时间安排

时间实验内容8:00-9:30讲解本实验的基本原理及相关知识9:40-13:30质粒DNA的提取13:30-16:00电泳、测OD26O和OD28016:00-17:00准备下次实验、灭菌质粒DNA提取的相关知识质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA

如何去除下列物质？蛋白基因组DNARNA

糖类脂类小分子物质

碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性pH，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性核酸的凝胶电泳电泳：带电粒子在电场中的涌动现象丙烯酰胺凝胶电泳

5bp—500bp（分辨率高，1bp)琼脂糖凝胶电泳

200bp—50kb（分离范围广、方便）琼脂糖介质结构均一，含水量大（98-99%），可通过调整琼脂糖的浓度改变孔径的大小，起到分子筛的作用核酸为两性分子，在pH3.5时，碱基上的氨基解离而磷酸基团中只有第一个磷酸解离，整个分子带正电；pH8左右时，碱基几乎不解离，而磷酸全部解离，整个分子带负电胶浓度（%）线性DNA分离范围（kb)0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-42.00.1-3在碱性环境下，不同的核酸分子由于具有相同的磷酸戊糖结构，几乎具有相同的电荷密度，其电泳行为与SDS类似，线性分子在凝胶中的迁移率与其所含碱基对数目的对数值成反比。可以近似用于估算分子的大小

影响迁移率的因素

DNA分子的大小琼脂糖凝胶的浓度

DNA的构象所加电压一般5V/cm

电场方向染料的存在与否电泳缓冲液的组成常用电泳缓冲液0.5XTBE5X储液1XTAE50X储液凝胶载样（上样）缓冲液（loadingbuffer)增加样品密度使样品带颜色，起指示作用常用染料EB:溴化乙锭，加入胶中或电泳后染色。EB插入核酸碱基平面，吸收紫外光的能量产生荧光，荧光的强度与DNA的量在一定范围内成正相关SYBR:新型低毒，高灵敏度荧光染料，可直接加入样品中，价格较昂贵胶浓（%）溴酚蓝二甲苯青0.61kb10.6kb2kb1.40.2kb1.6kb20.15kb核酸定量紫外吸收法比尔-朗伯定律：ODλ=єc双链DNA：1OD260

＝50ug/mL单链DNA和RNA：1OD260

＝40ug/mL单链寡核苷酸：1OD260

＝33ug/mL优点：快速，不破坏样品缺点：灵敏度低，要求样品较纯OD260／OD280：用于表示蛋白制品被核酸污染的程度，也可用来表示核酸被蛋白污染的程度，但核酸的消光系数较高，只有存在较多的蛋白污染时才能反应出来纯DNA：OD260:OD280=1.8纯RNAOD260:OD280=2.0纯蛋白：OD260:OD280=0.57EB或其它染料染色法:设置标准样品较纯样品：直接测OD260含较多杂质：EB或其它染料估测实验流程质粒DNA的提取接含PUC18(或pET21a)质粒的单菌落于3mlLBAmp+液体培养基中

370C，190rpm振荡培养过夜

6000rpm、离心2min，收集菌体

100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温10min

加入200uL溶液II（振荡混匀），冰上静置5min裂解菌体

加入150uL溶液III（振荡混匀），冰上静置15min质粒DNA复性

12000rpm，离心15min

上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀）

12000rpm，离心15min

上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀）

12000rpm，离心15min

上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），-200C30min

12000rpm，离心15min

沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心）

12000rpm，离心10min

沉淀超净台中风干

沉淀用20uLRTE溶解，-200C保存质粒DNA的电泳鉴定1%琼脂糖凝胶20mL(用buffer配)0.5xTBE100mL2uL质粒DNA+1uL10xloading+1uLSYBR+3uL无菌水80伏恒压电泳结果用凝胶成像仪分析照相质粒DNA的定量分析质粒DNA稀释200倍（用TE缓冲液稀释），总体积300uL灭菌：1mL、200uL枪头各一盒/2组

0.2mLPCR管30个/全班，1.5mL小指管30个/2组PCR基因扩增及扩增产物的回收

时间安排

时间实验内容8:00-9:00准备PCR扩增反应体系9:00-10:30PCR扩增、讲解本实验的基本原理及相关知识10:30-12:30PCR扩增、准备电泳凝胶和下次实验试剂13:00-14:30电泳14:30-17:00PCR扩增产物的回收、灭菌5’3’3’5’高温变性低温退火中温延伸不断循环聚合酶链式反应示意图目的片段模板引物对基本原理聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction),即PCR技术在合适条件下，这种循环不断重复,前一个循环的产物可作为后一循环的模板参与DNA的合成，最终使产物DNA的量按2n方式扩增理论上讲经过30次的循环反应,DNA扩增倍数为106~109PCR的特点:

特异性高、灵敏度高、快速、简便、无放射性、既可扩增DNA也可扩增RNA反应体系模板：DNA或RNA引物：sense和antisense

Taq酶：耐热DNA聚合酶dNTPMixture底物PCRbuffer：10mmol/LTris-HClpH8.4(200C)50mmol/LKClMg2+0.1mg/mL乙酰BSA引物的设计的总原则：扩增的效率和特异性长度：15—30bp碱基尽可能随机分布（G+C含量45-55%）引物内部不能形成二级结构两引物间不应有互补链存在3’端一定要与模板严格配对5’端可引入突变，加酶切位点等辅助软件：Primer5，Oligo，DNAsis等引物Tm：DNA分子一半为单链，另一半为双链时的温度称为该复合体的溶解温度Tm，与G+C含量有关PCR引物设计AKPCDS5542038引物15’GTCGCGGATCCATGTCACGGCCGAGAC3’BamH1CDS5’AGCTGTCATAAAGATGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCT…………….…………………….……………….……………….CDS

….CATGAAAGCCGCTCTGGGGCTGAAATAAAACCGCGCCCGG3’引物2

HindⅢ3’GAGACCCCGACTTTATTTCGAACAGCG5’扩增条件的优化优化反应参数：退火温度和时间、变性温度和时间优化Mg2+浓度模板的纯度，优化模板浓度优化dNTP的浓度优化引物浓度PCR仪：热盖、升降温速度、精度PCR管的质量等PCR的应用目的基因的获得基因组克隆DNA序列分析RNA分析基因突变基因组的比较研究医学疾病诊断等PCR扩增产物的分析琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物的回收回收的方法很多，主要目的是去除Taq酶等，取出目的DNA片段进行后续操作低熔点琼脂糖法离心柱过滤离心柱吸附玻璃奶吸附实验流程PCR扩增2.5mmol/LdNTPMixture2.0uL10xbufferMg2+Free2.5uLEx－TaqE1uL（1U）10pmol/uLsense1uL10pmol/uLantisense1uL模板DNA1uLMgCl2(25mmol/L)1uLddH2O16.5uL940C,2’

940C,1’

420C,1’

720C,2’

720C,10’|30cycles|PCR产物的电泳1xTAE150mL0.8%琼脂糖凝胶20mL(用1xTAE配)25uLPCR产物+3uL10xloading(含SYBR荧光染料)80伏恒压电泳PCR产物的回收（玻璃奶吸附法）

1.

切胶、称胶重2. 每100mg胶加入300uL溶胶液，500C溶胶(一定要溶解)将在-200C冻存的玻璃奶解冻，振匀!!在溶解后的胶液中加入10uL玻璃奶，吹打均匀，冰浴沉淀10min5.10,000rpm，离心1min，弃上清6.在离心所得沉淀中加入200uL稀释液，吹打均匀，10,000rpm离心1min，去上清，如此洗两次（稀释液：3倍体积浓缩洗胶液加入7倍体积无水乙醇）7.超净台中凉干（也可在500C干燥）8.加入20uLTE，吹打均匀，600C保温5-10min，12,000rpm离心2min，收集上清（检测是否含有DNA

）,-200C保存配试剂：1.组织匀浆液100mL

10mmol/LTris-HClpH8.025mmol/LEDTA100mmol/LNaCl2.酶解液30mL

（灭菌后再加蛋白酶K和SDS)20mmol/LTris-HClpH8.050mmol/LEDTA200mmol/LNaCl200ug/mL蛋白酶K1％SDS

3.生理盐水1000mL

4.3mol/LNaAcpH5.230mL

先用15mL水溶解固体NaAc

再用3mol/L乙酸调pH5.2，最后定容（试剂1－4为下一个实验的试剂，本周准备）灭菌试剂1－4枪头：1mL

、200uL各一盒小指管:2.0、0.5mL各20个DNA重组－限制性酶切和连接

哺乳动物基因组DNA的分离

时间安排时间实验内容8:00-8:30准备限制性酶切反应体系8:30-10:30370C酶解3小时、讲解本实验的基本原理及相关知识10:30-12:00370C酶解3小时、准备下次实验、灭菌12:00-15:00纯化酶切载体和目的基因、连接反应15:00-17:00哺乳动物基因组DNA的分离(到酶解过夜)DNA重组DNA重组:外源DNA分子与载体的连接，即将外源目的基因装进载体的过程酶切连接转化筛选重组方法类型要求特点平端高浓度的连接酶限制酶位点消失，效率低，有串联拷贝不同粘端载体酶解后需纯化限制酶位点保留，单向插入，常用相同粘端用磷酸酶去掉5’-磷酸限制酶位点保留，有串联拷贝和方向插入3’AT-vectorPCR产物可直接克隆+酶切连接转化筛选Amp+影响重组效率的因素酶切效果载体和目的基因的比例细菌的生长状态(5x107个/mL)感受态细胞的质量试剂的质量外源DNA的质量与数量器皿的洁净度污染—尽量所有打开器皿盖的操作都在超净台中进行思考题若无阳性克隆，原因？如阴性对照中长出菌，原因？在Amp培养板中，菌的密度过高或培养时间过长时会在阳性菌的周围长出一些小的卫星菌落，它们是Amps的，原因？重组子的筛选1.提取质粒，酶切，电泳验证2.抗药性筛选法，插入失活3.营养缺陷型筛选法4.杂交法：原位杂交，Southern5.测序6.表达产物的检测：测活、电泳、蛋白印迹7、α互补载体中引入LacZ’基因，包括LacZ的调控序列和编码氨基端146Aa（α-肽）的序列，表达产物无活性，而在受体细胞中，染色体DNA上含有LacZ的编码β-半乳糖苷酶羧基端的序列，其产物也无活性。二者结合才能有全酶的活性—α-互补。将无色的5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷(x-gal)底物水解为蓝色的5-溴-4-靛蓝在146Aa（α-肽）编码区中插入了一个多克隆位点且不破坏其阅读框，当有外源基因插入时，则无完整的α-肽生成，β-半乳糖苷酶无活性，菌落白色，而无外源基因插入时，长出蓝色菌落。有些质粒LacI缺失，不用IPTG诱导

启动子1LacI启动子2操纵子LacZLacYLacA阻遏蛋白

LacZ’乳糖操纵子IPTG实验流程连接反应体系AKP3uLPUC183uL10xligasebuffer1.0uLT4DNAligase0.5uLddH2O2.5uL酶切反应体系管号tube1tube2核酸15uLAKP7uLPUC1810xbufferK2uL1uLddH2O1uL0BamHI1uL1uLHandIII1uL1uL

370C酶解3小时分别将tube1和tube2中的样品先加入1/10体积的3mol/L

NaAc（pH5.2)，再加2倍体积的无水乙醇，-200C沉淀30分钟，12000rpm离心15min沉淀再用75%乙醇洗涤，12000rpm离心15min，干燥后加5uLTE溶解产物按连接反应体系进行连接反应感受态细胞的制备：见前面的实验转化及复苏1.取200uL感受态细胞，加入10uL连接产物

取200uL感受态细胞，加入2uL无菌水（对照1）取200uL0.1M的CaCl2，加入5uL连接产物

（对照2）用枪头混匀，冰上放置30min。阴性对照的目的？2.420C循环水浴热击90秒，冰浴2分钟3.每管加800uLLB液体培养基，370C慢摇（150rpm）1小时4.在预制的LB琼脂平板上，加40uLXgal（20mg/mL

）和40uLIPTG（20mg/mL）溶液，均匀涂布于琼脂平板表面5.100uL或50uL已转化的感受态细胞，涂布在上述含Amp的培养皿中，平板向上静置30min6.倒置培养过夜（370C）重组子的筛选抗性筛选蓝白斑筛选提取比较重组质粒的大小酶切鉴定：观察是否含有已知大小的重组的目的基因片段哺乳动物基因组DNA的分离及其定性定量分析提纯的思路1.基因组DNA的特性：分子量较大、易断（如何保证DNA分子的完整性？）2.组织和细胞的破碎3.要去处的物质：蛋白、多糖、脂类、RNA和小分子物质

所提取的DNA片段的大小：100—150kb用途：Southern杂交、基因组DNA文库的构建实验流程

基因组DNA的提取：0.2g鼠肝，冰冷生理盐水洗3次，剪碎

碎鼠肝转入玻璃匀浆器中，加入2mL匀浆液，匀浆6次（冰上操作）

匀浆液转入2mL小指管，40C,5000rpm离心2min,

沉淀加0.4mL无菌水，吹散，再加0.4mL酶解液，慢慢颠倒混匀

550C水浴酶解过夜，40C存放

加RNase,终浓度200ug/mL，370C保温60min

加等体积酚/氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀，冰上平倒静置10min

40C，10000rpm离心10min，用扩口枪头取出上清

上清加等体积氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀

40C,10000rpm，用扩口枪头取上清

上清加1/10体积的NaAc和加2倍体积的无水乙醇慢慢混匀，-200C静置30min

12000rpm离心15min，弃上清

沉淀用1mL75%冷乙醇洗两次，每次12000rpm离心10min，弃上清

超净台中干燥加50uLTE,40C溶解过夜，-200C保存电泳：

0.3%琼脂糖凝胶20mL(用TBE配)4uLDNA+5uLH2O+1uL10xloading（含荧光染料SYBR）

80伏恒压电泳，凝胶成像仪观察和分析结果基因组DNA的定量分析：基因组DNA稀释300倍（用TE缓冲液稀释），总体积300uL配试剂：1.0.1mol/L的CaCl2100mL2.LB液体培养基110mL

胰蛋白胨（typtone)1.1g

酵母提取物（yeastextract)0.55g

NaCl1.1g

加部分水溶解后加22μL5mol/LNaOH，定容到120mL

两个40ml到250mL锥形瓶，其余的分装到大试管中（3mL/管）3.LB固体培养基100mLLB液体培养基中含1.5％的琼脂

灭菌后待温度降到600C左右，加入Amp，立即铺平板灭菌1.试剂1－32.小指管：2.0、1.5mL各40个/2组

0.5mL小指管20/2组3.枪头：200uL1盒/组1mL1盒（扩口枪头30个）/组4.50mL离心管2个／组明天上午7:45收灭菌的东西及平板，下周三下午接菌预培养DNA重组－重组子的转化

哺乳动物基因组DNA的分离（续）

时间安排时间实验内容8:00-8:30接菌8:40-10:30培养2.5－3小时、基因组DNA的分离10:30-11:30培养2.5－3小时、基因组DNA的分离、准备电泳凝胶11:30-12:30午饭12:30-17:00感受态细胞的制备、重组子的转化、复苏、涂平板、电泳并观察结果、配试剂灭菌明天上午7:45收灭菌的东西及平板，下周三下午接菌预培养灭菌小指管：2.0、1.5mL各40个/2组

0.5mL小指管20/2组3.枪头：200uL1盒/组1mL1盒/2组DNA重组－重组子的筛选重组子转化表达菌株

时间安排时间实验内容8:00-8:30接菌（表达菌株）8:40-12:00培养2.5－3小时、质粒DNA的提取、准备电泳凝胶12:00-15:00质粒DNA的限制性酶切，电泳并观察结果12:30-17:00感受态细胞的制备、重组子的转化、复苏、涂平板、配试剂灭菌配试剂灭菌1.TM液体培养基40mL2.枪头

200ul1盒

1ml1盒明天上午7:45收灭菌的东西及平板，下周三下午接菌预培养外源基因在大肠杆菌中的诱导表达

时间安排时间实验内容8:00-8:30接菌8:30-10:30菌体培养、讲解本实验的基本原理及相关知识10:30-11:20配试剂和准配实验11:20-16:00加IPTG，诱导表达4.5小时13:00-16:00设计实验讨论16:00-17:00离心PromoterRibosomebindingsiteGeneTerminatorATGTAADNARNAProtein大肠杆菌中基因表达的重要信号启动子和载体系统受IPTG诱导的表达载体lac启动子：如PUC，pGEM，pSK等，表达的蛋白与β－半乳糖苷酶氨基端融合。更大程度的诱导lac启动子需CAP（crp基因产物，cAMP激活蛋白）参与，不能用以葡萄糖为炭源的培养基阻遏蛋白IPTG启动子1LacI启动子2操作子LacZ’多克隆位点trp-lac(tac或trc)启动子：由trp启动子-35区和lacUV5启动子-10区融合而成，受lacI阻抑物调控而不受CAP介导的cAMP调控机制的调控。如：pKK223-3T7噬菌体启动子：在含T7噬菌体启动子的载体中，外源基因的表达受T7噬菌RNA聚合酶调控带有colE1复制区，带有Amp或Kan抗性表达效率高

LacIpET大肠杆菌基因组Lac启动子T7启动子IPTG诱导IPTG诱导

大肠杆菌

RNA聚合酶T7基因1T7RNA聚合酶灭活T7溶菌酶基因T7溶菌酶T7RNA聚合酶靶基因pET系统调控元件LacILac阻遏物Lac阻遏物DE3LacOLacOpLysS

orE受温度诱导的表达载体：PL启动子λ噬菌体PL启动子受温度敏感型阻抑物cIts857调控，cIts857在低温下能抑制PL驱动的转录，而高温则不能如：pHUB系列，pPLc系列等PLcIts857+宿主420C靶基因融合表达载体将两个或多个开放阅读框架按一定的顺序连在一起表达成一个杂和蛋白靶蛋白连接在运载蛋白的N-端或C-端GST系统：将GSTs(谷光苷肽S-转移酶）与外源蛋白融合表达后，可用GST－琼脂糖柱纯化，用GST或蛋白酶洗脱聚组氨酸－Ni系统：将外源蛋白与聚组氨酸融合表达，暴露的多聚组氨酸能结合于固化Ni树脂，用酸性米唑洗脱融合表达载体启动子ATG运载序列切割序列多克隆位点靶蛋白附着于已知酶功能和／或抗原组成的结构域，有利于靶蛋白的标记与纯化靶蛋白与信号肽相连，可以将融合蛋白分泌到特定的细胞区运载蛋白能保护靶蛋白免受原核宿主的蛋白酶降解运载蛋白可以改变靶蛋白溶解性，防止形成不溶性包涵体表达系统：

大肠杆菌、枯草芽孢杆菌哺乳动物细胞、昆虫酿酒酵母、植物实验中，要根据所要表达的蛋白质的大小、蛋白质的需要量、是否需要活性以及实验室的条件等综合考虑选择合适的宿主-载体系统大肠杆菌遗传图谱明确，容易培养，费用底，已有许多成功的先例，是首选的表达系统，但大肠杆菌中缺少翻译后修饰系统，一些修饰后才有活性的蛋白必需选择真核细胞为宿主分离基因构建载体转化筛选鉴定优化表达条件表达条件的优化

翻译效率的优化:启动

ATG和SD序列之间的距离(5-7个核苷酸)

翻译起始区的二级结构减少SD序列核苷酸之间的二级结构密码子的使用:稀有密码子和密码子的偏倚性培养条件的优化:培养温度、诱导物的浓度、培养基的组成和pH等可溶性表达不溶性表达融合表达非融合表达实验流程1.预培养：接一单菌落到3mL含Amp的LB培养基中，370C、190rpm振荡培养过夜2.取0.5mL菌液转移到50mL含Amp的LB液体培养基的锥形瓶中，

370C、250rpm振荡培养3小时，至OD6000.7-0.83.加入IPTG（40ug/mL）4.继续在370C、250rpm振荡培养4.5小时5.离心6000rpm，40C，10min6.沉淀在－200C冻存配试剂和准配实验1、0.1%DEPC1500mL2、4mol/L异硫氰酸胍50mL3、2mol/LNaAcpH4.830mL4、4mol/LLiCl20mL5、3mol/LNaAcpH5.230mL（试剂2－5均用0.1%DEPC配制）灭菌1、0.1%DEPC20mL2、4mol/L异硫氰酸胍3、2mol/LNaAcpH4.84、4mol/LLiCl

5、3mol/LNaAcpH5.26、1.5mL

小指管20个

0.5mL

小指管10个7、枪头200uL1盒

1mL1盒

5mL6支8、50mL离心管三个9、研钵一套，剪刀一把(剪刀、研钵、耗材等均用0.1%DEPC处理后再灭菌)植物总RNA的提取及其定性定量分析

时间安排时间实验内容8:00-9:00讲解RNA提取的基本原理及相关知识9:10-15:30RNA提取,配制RNA电泳的琼脂糖凝胶15:30-17:00RNA电泳,测定紫外吸收，准备下次实验目的基因的获得TR-PCRNorthern杂交CDNA克隆核酸酶保护实验体外转译差异显示等为什么要提取RNA?核糖核酸核蛋白体不稳定性,易被降解不均一性:rRNAmRNAtRNA及小分子RNARNA有哪些特性?目标：

保证分离RNA的完整性、纯度、产率尽量简化操作步骤、缩短提取过程、以减少各种有害因素对RNA的破坏、降低杂质的污染到最低程度等

RNA的降解：物理、化学、酶学－－RNA酶（外源：环境、器皿、耗材、试剂；内源：组织本身含有的RNA酶）试剂专用，最好使用新开封的,分小份保存试剂，用后丢弃器皿、耗材、取液枪专用勤换手套等如何破坏RNA酶的活性？变性剂：异硫氰酸胍、苯酚、氯仿等抑制剂：DEPC、氧钒核糖核苷复合物、RNA酶蛋白抑制剂、巯基乙醇（或DTT）等在实验之前应该考虑的问题：选材和取材：原核、酵母、植物、动物、组织破碎：物理法、化学法、酶法破碎后的无细胞体系含有什么：细胞残渣、核酸（DNA和RNA）、蛋白质、蛋白聚糖、糖类、脂类、色素、小分子物质等去掉什么留下什么如何去掉不需要的成分－－实验流程是什么实验流程在一灭菌50mL离心管中加入:

4mol/L异硫氰酸胍4mL

苯酚3mL2mol/LNaAc(pH4.8)0.3mL

氯仿0.6mL

避光培养小麦10天

称取1.2g小麦苗的叶片,冰浴剪碎

液氮研磨叶片成粉末,转入已准备好的离心管中

混匀,冰浴30min（？）

40C,10000rpm,15min

上清至另一离心管中

加2倍体积无水乙醇,-200C,1小时

40C,10000rpm,15min

弃上清,沉淀中加4mol/LLiCl1mL,吹散

移入1.5mL小管,冰浴1小时

40C,13000rpm,15min

弃上清，沉淀加入400uLDEPC水,400uL氯仿混匀（？），13000rpm，6min

上清加1/10体积3mol/LNaAc(pH5.2)，2倍体积无水乙醇混匀，-200C,30分钟

13000rpm，15min

沉淀用70%醇洗两次,每次离心

室温稍干燥

沉淀加50uLDEPC水溶解(-200C保存)RNA电泳：制胶：1％变性琼脂糖胶称取0.2g琼脂糖，加入DEPC水12.6mL，5×电泳缓冲液4mL，加热使溶解，稍冷却（60－65℃）加入37％甲醛3.4mL和4μLGelStar混匀（或电泳完以后用EB染色），室温凝固30分钟(通风橱操作)7μL样品+1μL样品缓冲液80V恒压电泳测OD260和OD260

／OD280结果：18SrRNA1.8Kb-2.0Kb28SrRNA4.6Kb-5.3KbmRNA0.6-5Kb(1.5-2.0Kb)（80-85%rRNA,28S,18S,5S；10-15%tRNA

及小分子RNA；1-5%mRNA）思考题1、如何分离提取脂类和糖类含量高的组织的总RNA？2、如何分离提取RNA酶含量或活性含量高的组织的总RNA？3、如何分离提取mRNA？4、还有其它简单的方法提取RNA吗？配试剂1. 破碎缓冲液200mL50mMTris-HClpH8.02mMEDTA 测活液30mL50mMTris-HClpH8.50.2mg/mlBSA5mMMgCl2

10mMpNPP3.终止液300mL0.2MNa3PO4

4. 1.5MTris-HClpH8.8，100mL5. 0.5MTris-HClpH6.8，100mL30%Acr/Bis储液200mL

过滤（棕色瓶）7. 10%AP10mL，－200C保存5x电极缓冲液500mL

室温存放R-250染色液500mL

（棕色瓶）10.10xPBS储液

137mMNaCl

＋2.7mMKCl10mMNa2HPO4

＋2mMKH2PO4

溶于900ml水后用HCl调pH7.4后定容到1000ml11.印迹缓冲液1000mL12.丽春红染色液300mL13.封闭液300mL5%脱脂奶粉（用1xPBS配制）14.