第八章培养基及发酵设备灭菌

第八章培养基及发酵设备灭菌

一、湿热灭菌原理二、微生物的热死动力学1、灭菌概率与标准如果每个微生物的致死条件相同，那么在t时刻，灭菌系统中仍有N个微生物存在的概率：2、对数残留定律3、温度对微生物热死的影响

微生物热死动力学常数与温度的关系可表示如下：三、培养基的灭菌方式1.分批灭菌指每批培养基全部流入发酵罐后，在罐内通入蒸汽加热至灭菌温度，维持一定时间，再冷却到接种温度。优点：（1）设备造价低，不需另设加热、冷却装置；（2）操作要求低，可手动控制；（3）适用于种子罐和小批量生产规模；（4）适用于介质中含有大量固体物质的场合。缺点：（1）加热和冷却时间长，使发酵罐利用率低；（2）易发生过热而破坏营养成分的现象。培养基间歇灭菌过程中的温度变化情况分批灭菌的操作：(1)灭菌前检查检查发酵罐及其管路的严密程度和清洁程度；检查蒸汽的质量和压力；检查净化空气的无菌程度等。(2)进料培养基原料经与水充分搅匀并粗滤后，边搅拌边进料，同时检查电动机负荷及传动设备运行是否正常。(3)进汽预先排除蒸汽管路的冷凝水和冷却管路的冷却存水；进汽后应继续搅拌，并使有关灭菌管路都流通蒸汽，确保压力要求；在维持过程，使进汽和排汽平衡，确保罐压稳定，防止罐压下降导致泡沫上升；在最低限维持时间内大量进汽，促使料液产生较大翻动而露出液面等。(4)灭菌后冷却保温灭菌结束，依次关闭排汽阀和进汽阀，立即引入冷却水，并引入无菌空气保压。如果罐内泡沫上升，可采用快速升压、大量排汽的办法处理，或开启罐顶压料用空气管阀门，略提高罐压，使泡沫消除。培养基间歇灭菌过程中的温度变化情况分批灭菌的操作：(1)灭菌前检查检查发酵罐及其管路的严密程度和清洁程度；检查蒸汽的质量和压力；检查净化空气的无菌程度等。(2)进料培养基原料经与水充分搅匀并粗滤后，边搅拌边进料，同时检查电动机负荷及传动设备运行是否正常。(3)进汽预先排除蒸汽管路的冷凝水和冷却管路的冷却存水；进汽后应继续搅拌，并使有关灭菌管路都流通蒸汽，确保压力要求；在维持过程，使进汽和排汽平衡，确保罐压稳定，防止罐压下降导致泡沫上升；在最低限维持时间内大量进汽，促使料液产生较大翻动而露出液面等。(4)灭菌后冷却保温灭菌结束，依次关闭排汽阀和进汽阀，立即引入冷却水，并引入无菌空气保压。如果罐内泡沫上升，可采用快速升压、大量排汽的办法处理，或开启罐顶压料用空气管阀门，略提高罐压，使泡沫消除。2.连续灭菌指培养基在发酵罐外连续不断的加热、维持和冷却，然后进入发酵罐。优点：（1）容易达到较高的温度，缩短灭菌时间，减少营养物质的破坏；（2）操作条件恒定，灭菌质量稳定；（3）易于自动控制，降低劳动强度；（4）系统避免反复加热和冷却，提高热利用率。分批灭菌的操作：(1)空罐灭菌采用大进汽方式进汽，以使罐顶各开孔部位的有关管路彻底灭菌的阀门，再关小排汽保持压力160—180千帕(128～130℃左右)，流通蒸汽灭菌30分钟，并在稍开进汽阀和排汽阀的条件下闷罐灭菌30分钟。灭菌结束，将罐压降至低于空气过滤器压力，立即进无菌空气保压，并通冷却水冷却。(2)连续进蒸汽加热连消时，先将物料预热至60～75℃，以减少蒸汽加热时水汽的撞击声。务必保持总蒸汽压达500千帕，使其接近连消泵出口压力(600千帕)，培养基流速才均匀稳定，否则影响灭菌质量。连消塔温维持在126～32℃，维持罐罐压为400千帕，一般5分钟已能达到彻底灭菌要求。(3)灭菌后冷却物料冷却前，冷却管内应先充满料液。喷淋冷却至40～50℃，再将料液排入空罐。排出无菌料液务必防止“倒吸”。即物料管路灭菌后，管内蒸汽压稍降，应立即使无菌料液充满管道，再喷淋冷却，以免管道冷却后压力急剧下降造成负压，外界空气从管路渗漏处窜入。

3.固体培养基的灭菌转鼓和灭菌机常用于酒厂和酱油厂的固体物料的灭菌。空气过滤第一节空气除菌的要求和方法一、空气中微生物的分布空气的微生物，大多是细菌和细菌孢子，也有酵母、真菌和病毒。一般空气中按含菌量为103—104个／m3来设计空气除菌系统。空气中的尘埃数与细菌数的关系如下：

y=0.003x–2.6

式中y—空气中的微生物数量(个／m3)，x—空气中的尘埃颗粒数量(个／m3)。二、发酵对空气无菌程度的要求三、空气除菌方法1、热杀菌2、辐射杀菌3、静电除菌4、过滤除菌

对空气灭菌的要求一般按10-3的染菌机率，即在1000次培养过程中，只允许一次是由于空气灭菌不彻底而造成染菌，致使培养过程失败。第二节过滤除菌原理一、惯性撞击截留作用二、拦截截留作用三、布朗扩散截留作用四、重力沉降作用五、静电吸引作用上述五种过滤除菌原理中，主要是惯性截留、拦截截留和布朗扩散作用，沉降和静电吸附作用可忽略布计。一般当气流速度大于0.1米/秒时，惯性拦截作用为主，当气流速度小于0.1米/秒时，拦截截留和布朗扩散作用为主。第三节空气过滤对数穿透定律假定颗粒一旦被截获就不再逃逸，而且在与气流垂直的截面上颗粒是均匀分布的，那么在任何单位厚度介质层中颗粒被捕截的比例相同。即：其中：c—颗粒浓度，个／m3；x—介质层中某一截面深度，m；K—除菌常数，m—1。将上式积分后得：其中：C0—进口空气的菌浓度，个／m3；No，N—一定体积空气在除菌前后的总菌数，个；L—过滤介质厚度，m。上式表示穿透的菌数与原菌数之比的对数值与介质厚度成正比，因此也称对数穿透定律。式中N/N0或C/C0为微生物的穿透率，那么除菌效率η为：

CNη=1-=1-即η=1-exp(-KL)C0N0

若N/No=0.1，即颗粒的90％被捕获截留，10％穿透，相应的介质层厚度用L90表示。则由可得：ln0.1=-KL90因此

2.303L90=

KL90反应了介质过滤性能的优劣，我们通常可用L90值的大小来比较各种过滤介质的性能，L90小则表示过滤性能好。第四节空气过滤介质一、常用空气过滤介质1、棉花2、玻璃纤维3、活性碳4、超细玻璃纤维5、石棉滤板6、烧结材料过滤介质7、新型过滤介质二、提高过滤除菌效率的措施

1、减少进口空气的含菌数。方法有：①加强生产场地的卫生管理，减少生产环境空气中的含菌数；②正确选择进风口，压缩空气站应设上风向；③提高进口空气的采气位置，减少菌数和尘埃数；④加强空气压缩前的预处理。

2、设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质。

3、设计合理的空气预处理设备，以达到除油、水和杂质的目的。

4、降低进入空气过滤器的空气的相对湿度，保证过滤介质能在干燥状态下工作。方法有：①使用无油润滑的空气压缩机；②加强空气冷却和去油、水；③提高进入过滤器的空气温度，降低其相对湿度。第五节空气过滤系统一、空气过滤流程第九章微生物培养方式及过程

第一节发酵微生物培养方法一、固体培养

（一）表面培养表面培养是一种好氧静置培养方法，针对容器内培养基物态又分为液态表面培养和固态表面培养。相对于容器内培养基体积而言，表面积越大，越易促进氧气由气液(气固)界面向培养基内传递，包括茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养。菌的生长速度与培养基深度有关，单位体积的表面积越大，生长速度也越快。氧的供给常成为发酵的限速因素，所以发酵周期长，占地面积大。优点是不需要深层培养时的搅拌和通气，节省动力。如醋酸、柠檬酸发酵和曲盘制曲。（二）通风固体培养通风固体培养通风制曲培养。起源于我国酿造生产特有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。固体培养具有以下优点：

①原料：以谷物和农业废物为主要原料，只需外加适量水分、无机盐等。培养基组成简单。

②防止污染：利用霉菌能在水分较低的基质表面进行增殖的特性，在这种条件下，细菌生长不好，因此不易引起细菌污染。

③通气：无论浅盘或深层固体通风制曲，可以在曲房周围使用循环的冷却增湿的无菌空气来控制温湿度，并且能根据菌种在不同生理时期的需要，灵活加以调节。在固体培养中，氧气是由基质粒子间空隙的空气直接供给微生物，比液体培养时的用通气搅拌供给氧气节能。二、液体培养

（一）浅盘发酵培养（二）液体深层培养用液体深层发酵罐从罐底部通气，送人的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。这种由罐底部通气搅拌的培养方法，相对于由气液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养法来讲，称为深层培养法。特点是容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度、与培养基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条件。现在发酵罐的容积最大为500—1000t，溶解氧、温度、pH值等均设有自控仪器或采用微机控制，推动着整个发酵工业的发展。深层培养基本操作的3个控制点是：

①灭菌②温度控制③通气、搅拌三、载体培养

载体培养脱胎于曲法培养，同时又吸收了液体培养的优点，是近年来新发展的一种培养方法。特征是以天然或人工合成的多孔材料代替麸皮之类的固态基质作为微生物的载体，营养成分可以严格控制，发酵结束，只需将菌体和培养液挤压出来进行抽提，载体又可以重新使用。载体的取材必须耐蒸汽加热或药物灭菌，多孔结构既有足够的表面积，又能允许空气流通。

第二节微生物生长的测定一、直接测定法1、显微计数法2、比色法3、干重测定法4、菌丝长度测定法5、平板计数法6、细胞堆积体积测定法7、液体稀释法8、粒子计数器法二、间接测定法1、根据细胞组分含量进行估算2、从培养基成分的消耗量来估算3、从细胞代谢产物来估算4、从发酵液粘度来估算5、从发酵的放热量来估算6、从发酵液酸碱度来估算

第三节分批培养

分批培养是一种间歇的培养方法，在生物反应器中装入培养基，灭菌（或在灭菌的生物反应器中加入经过灭菌的培养基），在适当的温度下接种，维持一定的条件进行培养。接种后，只通入无菌空气、消泡剂及调pH的酸碱外，不再加入其他物料，发酵结束后将全部培养液放出进行后处理。为了提高生物反应器的生产效率，通常采用多级分批培养的方法。一、分批培养中细胞的生长阶段（一）细菌的生长曲线1.延滞期(lagphase)2.对数期(logphase)

又称指数生长期(exponentialgrowthphase)3.静止期(stationaryphase)4.衰亡期(deathphase)二级分批培养流程（二）丝状真菌的生长曲线二、微生物的比生长速率

一、比生长速率在培养过程中，细胞浓度的增长速率与细胞浓度成正比：

dX/dt=μX

式中X为细胞浓度(kg／m3或个／m3)，为时间(s)；μ为比生长速率(s-1)。

根据上式，可知比生长速率相当于一级反应的速度常数，它也可表示为：

1dXμ=Xdt

比生长速率μm与细胞种类、培养温度、限制性基质浓度、pH等有关，在指数生长阶段，细胞的生长不受限制，比生长速率达到最大值并保持不变。若在时刻t1的细胞浓度为X1，则在时刻t2的细胞浓度为：

X2=X1exp[μm(t2-t1)]此时最大比生长速率为：

2.303lg(X2/X1)μm=t2-t1细胞浓度增长一倍所需要的时间td称为倍增时间（doublingtime）或增代时间（generationtime），为：td=0.693/μm

（二）影响比生长速率的因素营养物质的种类、浓度和比例温度pH溶解氧浓度产物三、分批培养中的基质消耗和产物生成1.得率系数2.基质消耗速率分批培养时,培养液中基质浓度的下降是由于细胞和产物的生成,如果营养物质是能源,还有一部分用于细胞的生命活动,则可表示为:3.产物生成速率

Goden将微生物发酵过程中产物的生成归纳为三种形式:(1)产物的生成与细胞生长完全相关(2)产物的生成与细胞生长部分相关(3)产物的生成与细胞生长不相关

第四节连续培养如果在分批培养的某一时刻，向生物反应器中以一定的流量不断加入新培养基，同时以相同流量不断取出培养液。由于不断有新培养基补充细胞的消耗，有害代谢产物不断被稀释排出，生物反应就可以长期进行下去，称为连续培养(continuousculture)。

第四节连续培养如果在分批培养的某一时刻，向生物反应器中以一定的流量不断加入新培养基，同时以相同流量不断取出培养液。由于不断有新培养基补充细胞的消耗，有害代谢产物不断被稀释排出，生物反应就可以长期进行下去，称为连续培养(continuousculture)。典型的实验室连续培养系统示意图一、连续培养的特点二、连续培养的类型1、恒化培养(chemostaticculture)2、恒浊培养(turbidostaticculture)。3、多级连续培养4、固定化细胞连续培养优势：①固定化可提供较高的细胞密度；②固定化减少了细胞的流失，使细胞可以反复利用；⑧固定化可以提供对细胞有利的微环境；④某些情况下，固定化可以使菌株的遗传性状稳定；⑤可以保护某些细胞免受剪切损伤；⑥简化了下游的细胞分离步骤。缺点：①固定化细胞的成本还比较高；②固定化过程中及固定化细胞使用时的污染控制比较困难；③细胞固定到固体载体中后，增加了营养物质、氧和产物的传质阻力，特别是好氧发酵时的氧传递问题比较难以解决；④固定化细胞在长期使用中的遗传稳定性也将成为问题；⑤一般只能用