荧光定量技术和常见问题

荧光定量技术和常见问题定量PCR是如何工作的第2页,共110页，2024年2月25日，星期天荧光定量PCR是什么一种实时监控目的基因PCR扩增的技术第3页,共110页，2024年2月25日，星期天定量PCR是如何工作的?传统PCR

具有以下基本要素dsDNA模版,primers引物,dNTPs核苷酸,PCRbuffer缓冲液,TaqpolymeraseDNA聚合酶等TGCAAACAGATTAGACATAGATAGACAGATTAGATAGACTTAGATGTTTGGCAACGTTTGTCTAATCTGTATCTATCTGTCTAATCTATCTGAATCTACAAACCGTMg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+TACGGAGCTGA第4页,共110页，2024年2月25日，星期天与传统PCR一样,反应在温度模块里循环进行:>双链DNA模板变性>引物与模板退火>引物延伸

新的扩增片段定量PCR是如何工作的?理论上每经过一个循环目的基因的数量都会增加一倍第5页,共110页，2024年2月25日，星期天在PCR混合液中含有荧光物质。定量PCR是如何工作的?第6页,共110页，2024年2月25日，星期天无论哪个型号，所有的荧光定量PCR仪都有三个共同的组成部分定量PCR是如何工作的?第7页,共110页，2024年2月25日，星期天PCRPCRLotsofPCRPCRproduct随着扩增的进行,荧光信号会随着PCR产物的增加而增加定量PCR是如何工作的?第8页,共110页，2024年2月25日，星期天Real-timePCR仪会记录每个循环经过每个滤光片的荧光信号变化定量PCR是如何工作的?Cycle1FilterASample1Level:第9页,共110页，2024年2月25日，星期天为什么要用定量PCR？

重复性好

灵敏度高

动力学范围宽一个好的定量PCR数据第10页,共110页，2024年2月25日，星期天1:重复性好第11页,共110页，2024年2月25日，星期天2:灵敏度高可以检测到低拷贝的目的基因第12页,共110页，2024年2月25日，星期天3:动态范围宽兼具重复性和准确性的起始模版浓度范围(越大越好)第13页,共110页，2024年2月25日，星期天为什么要用定量PCR？

快：节省时间和劳力（不用电泳检测）。第14页,共110页，2024年2月25日，星期天为什么要用定量PCR？

安全：不用EB或放射性物质第15页,共110页，2024年2月25日，星期天定量PCR的化学原理第16页,共110页，2024年2月25日，星期天支持的化学试剂SYBR®GreenITaqMan®第17页,共110页，2024年2月25日，星期天TaqMan®

中会使用到两段短片段序列，称为双向特异引物TaqMan®

化学原理

第18页,共110页，2024年2月25日，星期天第三段短片段序列，又称为探针,位于序列中间TaqMan®

化学原理

第19页,共110页，2024年2月25日，星期天报告染料Reporterdye淬灭染料Quencherdye探针标记两种

染料分子TaqMan®

化学原理

第20页,共110页，2024年2月25日，星期天Reporter没有荧光信号（发射）能量光(激发)完整的探针TaqMan®

化学原理

第21页,共110页，2024年2月25日，星期天光能然而，如果探针断裂了……TaqMan®

化学原理

第22页,共110页，2024年2月25日，星期天Denaturation变性(95ºC)TaqMan®

化学原理

第23页,共110页，2024年2月25日，星期天Annealing退火(60ºC)TaqMan®

化学原理

第24页,共110页，2024年2月25日，星期天Taq酶登场……TaqMan®

化学原理

第25页,共110页，2024年2月25日，星期天找到引物序列……TaqMan®

化学原理

第26页,共110页，2024年2月25日，星期天开始延伸(60ºC)TaqMan®

化学原理

第27页,共110页，2024年2月25日，星期天Extension延伸(60ºC)TaqMan®

化学原理

第28页,共110页，2024年2月25日，星期天Extension延伸(60ºC)TaqMan®

化学原理

第29页,共110页，2024年2月25日，星期天?Extension延伸(60ºC)TaqMan®

化学原理

第30页,共110页，2024年2月25日，星期天Taq酶很特别……具有核酸外切酶活性，可以‘吃掉’结合到模板上的DNA片段TaqMan®

化学原理

第31页,共110页，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

第32页,共110页，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

第33页,共110页，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

第34页,共110页，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

第35页,共110页，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

第36页,共110页，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

第37页,共110页，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

第38页,共110页，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

第39页,共110页，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

第40页,共110页，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探针TaqMan®

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第41页,共110页，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

第42页,共110页，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

第43页,共110页，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探针TaqMan®

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第44页,共110页，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

第45页,共110页，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

第46页,共110页，2024年2月25日，星期天TaqMan®

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第47页,共110页，2024年2月25日，星期天TaqMan®

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第48页,共110页，2024年2月25日，星期天TaqMan®

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第49页,共110页，2024年2月25日，星期天TaqMan®

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第50页,共110页，2024年2月25日，星期天嗝!TaqMan®

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第51页,共110页，2024年2月25日，星期天SYBR®GreenI化学原理第52页,共110页，2024年2月25日，星期天SYBR®GreenI染料第53页,共110页，2024年2月25日，星期天SYBR®GreenI染料第54页,共110页，2024年2月25日，星期天SYBR®GreenI染料第55页,共110页，2024年2月25日，星期天SYBR®GreenI染料的缺点非特异结合任意

双链DNA定量结果不准确非特异性PCR产物信号第56页,共110页，2024年2月25日，星期天使用熔解曲线Meltcurve(DissociationCurve)检查反应特异性Temperature

Fluorescence第57页,共110页，2024年2月25日，星期天Meltcurve:

导数图谱一个干净的峰=没有无关的产物Temperature

Fluorescence第58页,共110页，2024年2月25日，星期天Meltcurve的杂峰可能是引物二聚体第59页,共110页，2024年2月25日，星期天多余的峰是如何产生的?非特异扩增1、转录组中错误的目的基因。2、引物结合在正确的序列,但是既检测基因组DNA又检测cDNA(由于短的内含子,基因组DNA有较高的Tm值)。解决方法：设计引物时至少有一条跨过外显子的结合点

引物二聚体第60页,共110页，2024年2月25日，星期天到底用哪一种化学方法呢？TaqMan®,还是SYBR®Green?...第61页,共110页，2024年2月25日，星期天TaqMan®,还是...

SYBR®GreenI?优点更高的特异性

不会有引物二聚体干扰支持多重荧光实验设计实验方法易于优化缺点价格稍贵优点价格便宜大部分基因以及少量样品均适用缺点特异性稍差必须要做Meltcurves不支持多重荧光设计实验方法通常需要优化第62页,共110页，2024年2月25日，星期天定量PCR的数学原理第63页,共110页，2024年2月25日，星期天怎样获得结果首先让我们定义扩增曲线的各种参数。第64页,共110页，2024年2月25日，星期天PCR的动力学曲线和四个阶段第65页,共110页，2024年2月25日，星期天指数扩增期重复性准确性动态范围3个阶段中最佳时期第66页,共110页，2024年2月25日，星期天只有一个扩增期提供高质量的数据指数扩增期第67页,共110页，2024年2月25日，星期天基线基线（空白）信号的产生是由于背景引起的第68页,共110页，2024年2月25日，星期天阈值默认阈值=基线（背景）信号标准偏差x10第69页,共110页，2024年2月25日，星期天怎么获得结果第一步：确定Ct值第70页,共110页，2024年2月25日，星期天怎么获得结果第二步：比较Ct值第71页,共110页，2024年2月25日，星期天定量PCR的应用绝对定量相对定量阴阳性鉴定基因分型第72页,共110页，2024年2月25日，星期天定量PCR实验设计和流程

---绝对定量和相对定量第73页,共110页，2024年2月25日，星期天定量PCR的实验要素

目的基因样品标准曲线标准品监控系统故障阳性对照监控污染阴性对照校准生物学误差内参(管家基因)校准物理误差参比荧光降低随机误差重复实验第74页,共110页，2024年2月25日，星期天相对定量实验示例实验未处理样本处理后样本目的基因：Plat1实验目的：样本处理后，Plat1基因的表达量有什么变化？第75页,共110页，2024年2月25日，星期天实验流程对照样本第76页,共110页，2024年2月25日，星期天两种相对定量的方法比较Ct（ΔΔCt）法相对标准曲线法样本间目的基因的倍数关系第77页,共110页，2024年2月25日，星期天两种方法的区别

比较Ct(ΔΔCt)法

相对标准曲线法*已知各个基因的扩增效率*每个基因都要做一条标准曲线*不需要每次都做标准曲线*准确的扩增效率计算*简单,经济,通量较高*工作量大,成本高,通量较低第78页,共110页，2024年2月25日，星期天如何选择相对定量的方法第79页,共110页，2024年2月25日，星期天如何选择相对定量的方法第80页,共110页，2024年2月25日，星期天如何选择相对定量的方法在EXCEL中制作图表第81页,共110页，2024年2月25日，星期天如何选择相对定量的方法在EXCEL中制作图表斜率<0.1斜率>0.1比较Ct(ΔΔCt)法相对标准曲线法第82页,共110页，2024年2月25日，星期天ΔΔCt法必要条件：目的基因和内参基因必须有相一致的扩增效率，并尽可能接近100%。第83页,共110页，2024年2月25日，星期天ΔΔCt法如何确认扩增效率接近100%？每条引物一条标准曲线第84页,共110页，2024年2月25日，星期天ΔΔCt法标准曲线可以帮助判定扩增效率例如：斜率-3.3说明扩增效率接近100%；更小的负值（如-3.5）说明扩增效率小于100%公式：E=10(-1/斜率)-1第85页,共110页，2024年2月25日，星期天ΔΔCt法结果计算步骤一：内参基因均一化样本差异Ct目的基因-Ct目的基因=

ΔCt步骤二：处理样本和对照样本作比较

ΔCt处理样本-ΔCt对照样本=

ΔΔCt步骤三：使用公式计算

倍数变化

=2

-ΔΔCt第86页,共110页，2024年2月25日，星期天公式含义2

-ΔΔCt2=循环间扩增产物量的变化（PCR扩增产物倍增）ΔΔCt=处理样本和对照样本之间校正过大循环数的变化所以，这个公式告诉我们对照样本和处理样本之间目的基因的倍数变化。第87页,共110页，2024年2月25日，星期天ΔΔCt法计算示例第88页,共110页，2024年2月25日，星期天ΔΔCt法计算示例为了去除样本间加样量不同带来的误差，需要对数据均一化处理。第89页,共110页，2024年2月25日，星期天ΔΔCt法计算示例首先，选择对照样本；接着，均一化对照样本；然后，所有样本和对照样本进行比较。第90页,共110页，2024年2月25日，星期天ΔΔCt法计算示例最后，计算出倍数关系2

–ΔΔCt。第91页,共110页，2024年2月25日，星期天相对标准曲线法每对引物做一条相对标准曲线第92页,共110页，2024年2月25日，星期天相对标准曲线法计算示例表示倍数差异第93页,共110页，2024年2月25日，星期天绝对定量实验

目的：生成标准曲线，建立Ct值与浓度之间的线性关系；

要求：

浓度已知

标准品与待测样品的PCR效率一致，且接近100%

–仪器质量一致

–试剂质量一致：模板纯度、引物和探针的Tm值、酶活性、缓

冲液成分

–反应条件一致：循环参数相同、同一次实验标准品的准备第94页,共110页，2024年2月25日，星期天绝对定量实验Don’t:−制备3个点的2倍标准曲线要求：Do:−制备至少5个点的标准曲线(4logs)−去除离散的重复孔，或者有必要时去除整个梯度数据如何制备标准曲线第95页,共110页，2024年2月25日，星期天绝对定量实验

选择目标→提取/PCR→纯化→测定浓度→调整浓度→梯度稀释Ct值在17-30之间，覆盖全部样品浓度区间10倍连续梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v注：不可由标准品i分别加不同体积的稀释缓冲液直接得到标准品ii、iii、iv、v标准品梯度稀释方法第96页,共110页，2024年2月25日，星期天绝对定量实验扩增效率：每个循环中靶分子被作为模板利用的百分比。PCR效率的测定第97页,共110页，2024年2月25日，星期天常见问题分析第98页,共110页，2024年2月25日，星期天1.扩增效率为什么达不到100%主要原因：样品不纯扩增产物太长没有选择合适的引物退火温度引物的设计有错配模板的序列特殊（比如GC含量高）抑制物的存在第99页,共110页，2024年2月25日，星期天2.扩增效率为什么会大于100%主要原因：背景污染非特异性扩增第100页,共110页，2024年2月25日，星期天3.实验结果的重复性不好对每个样品我们都要做重复实验（通常至少为3个重复）目标是所有复孔CT值都相近(通常SD值小于0.167)第101页,共110页，2024年2月25日，星期天3.实验结果的重复性不好重复性好第102页,共110页，2024年2月25日，星期天3.实验结果的重复性不好重复性差第103页,共110页，2024年2月25日，星期天3.实验结果的重复性不好主要原因

加样误差（操作?加样器?）