上海生科院实验生物学酶工程2012-11-29

上海生科院实验生物学酶工程2012-11-29酶工程定义将酶所具有的生物催化功能,借助工程手段应用于社会生活的一门科学技术；利用酶催化的作用,在一定的生物反应器中,将相应的原料转化为所需要的产品；利用酶、细胞器或细胞的特异催化功能，通过适当的反应器工业化生产人类所需产品或达到某种特殊目的的一门技术科学。(大唐搜索)“工程”的定义(Webster)“酶工程”的定义运用酶学知识结合数学和/或其他系统性知识设计有实用价值的新酶(生物催化剂，固定化生物催化剂，生物催化反应体系,生物催化反应器。。。)超越常规实践技巧运用数学或系统性知识设计有实用价值的复杂体系教学目标在具备生物化学/酶学/微生物学等基本知识的前提下了解蛋白质重组表达和改造的基本概念，方法在文献调研基础上能独立设计蛋白质重组表达和改造的实验技术路线。课程基础张惠展 重组DNA技术与基因工程

钟扬 基因组学与生物信息学丁建平 蛋白质结构技术生物化学(氨基酸，酶学)蛋白质化学(蛋白质纯化，蛋白质结构)微生物学参考资料ColinRatledge《BasicBiotechnology》2001MartinChaplin《EnzymeTechnology》1990http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/index.htmlAndreasS.Bommarius《Biocatalysis》2004内容安排

(约45分钟休息10分钟)复习与简介复习酶的基本概念酶工程发展概况基础学习酶的生产方法重组表达酶的分离提取酶的固定化技术酶反应器提高酶的改造提问？酶学知识复习王镜岩《生物化学》第3版第8章酶通论酶是什么？有催化活力的蛋白质蛋白质一般不稳定,反应条件温和催化能力高效性,专一性化学选择性，区域选择性，立体选择性TheMechanismofEnzymeCatalysis酶与过渡态中间物的紧密结合，稳定了底物的过渡态结构，从而降低了底物形成其过渡态所需克服的能垒，提高了反应的速度酶学相关定义U酶活力单位

1分钟内转化1umol底物所需酶量Vmax最大反应速度酶分子所有的活性部位都被底物占据时的反应速度Km米氏常数反应速度达到Vmax一半时的底物浓度Kcat酶转换数

以每分钟每酶分子形成的产物的分子数表示的Vmax米氏方程HowAnEnzyme'sECNumberIsAssigned

FirstE.C.NumberSecondE.C.NumberMeans:ThirdE.C.NumberMeans:1:OxidoreductasesIndicatestheH+ore-donorthatundergoesoxidationIndicatestheacceptor2:TransferasesIndicatesthegrouptransferredFurtherinformationonthegrouptransferred3:HydrolasesIndicatesthenatureofthebondhydrolysedIndicatesthenatureofthesubstrate4:LyasesIndicatesthenatureofthebrokenbondFurtherinformationontheeliminatedgroup5:IsomerasesIndicatesthetypeofisomerismIndicatesthetypeofsubstrates6:LigasesIndicatesthetypeofbondformedOnlyusedinC-NligasesInallcases,thefourthECnumberisspecifictoaparticularreaction.酶的命名

EC编号规则

第一位第二位第三位氧化还原酶

氧化反应的供体是

H+还是

e-受体类型转移酶发生转移的基团种类发生转移的基团细分水解酶

水解的化学键种类天然底物类型裂合酶断裂的化学键种类脱去的基团种类异构酶同分异构体的种类

底物类型连接酶

形成的化学键种类仅限于C-N化学键连接E.C.number第四位取决于具体的反应过程国际酶学委员会EnzymeCommission(EC)酶的命名

氧、转、水、裂、异、合(连)

Oxidoreductases 氧化还原酶Transferases 转移酶Hydrolases 水解酶Lyases 裂合酶Isomerases 异构酶Ligases 连接酶ATP水解偶联国际酶学委员会EnzymeCommission(EC)酶知识复习小结酶是有催化活力的蛋白质酶与过渡态中间物的紧密结合，稳定了底物的过渡态结构，从而降低了底物形成其过渡态所需克服的能垒，提高了反应的速度酶分为6大类，酶的命名可以在上查询基础篇学习酶的生产方法重组表达系统酶的分离提取酶的固定化技术酶反应器酶工程的历史酶的历史在麦芽中发现淀粉酶 1833在胃中发现消化酶--胃蛋白酶 1836

1873

从小牛胃提取凝乳酶用于制酪Enzyme定名--意为"在酵母中" 1878钥匙-锁理论提出

1894

以米曲霉生产淀粉酶作为消化酶中间产物学说

米氏方程 1913获得脲酶结晶

酶是蛋白质 1926 1949液体深层发酵生产细菌α-淀粉酶固定化酶 1953操纵子学说酶生物合成机制 1960

1969

固定化氨基酰化酶生产L-氨基酸

1973基因工程技术

1978定点突变技术

1984TyrRS的蛋白质工程

1986重组酶生产

1993定向进化

1994DNAshuffling

酶的生产植物来源来源 酶 应用刀豆 脲酶 诊断木瓜 木瓜蛋白酶 烘焙，制酪，制革，

嫩肉粉，啤酒澄清无花果 无花果蛋白酶 嫩肉粉菠萝 菠萝蛋白酶 烘焙辣根 辣根过氧化物酶 诊断柠檬 β-糖苷酶 科研小麦 酯酶 酯水解与合成大麦 β-淀粉酶 烘焙，麦芽糖浆大豆 β-淀粉酶 烘焙，麦芽糖浆动物来源的工业用酶来源酶工业用途肝过氧化氢酶食品胰腺胰凝乳蛋白酶制革胰腺脂肪酶食品皱胃凝乳酶制酪胰腺胰蛋白酶皮革微生物来源的工业用酶EnzymeECnumberSourceIntra/extra-cellular

ScaleofproductionIndustrialuseBacterialenzymesa-AmylaseBacillusE+++Starchb-AmylaseBacillusE+StarchAsparaginaseEscherichiacoliI-HealthGlucoseisomeraseBacillusI++FructosesyrupPenicillinamidase1BacillusE-PharmaceuticalProtease4BacillusE+++DetergentPullulanase1KlebsiellaE-StarchFungalenzymesa-AmylaseAspergillusE++BakingAminoacylase4AspergillusI-PharmaceuticalGlucoamylaseAspergillusE+++StarchCatalaseAspergillusI-FoodCellulaseTrichodermaE-WasteDextranase1PenicilliumE-FoodGlucoseoxidaseAspergillusI-FoodLactase3AspergillusE-DairyLipaseRhizopusE-FoodRennetMucormieheiE++CheesePectinase5AspergillusE++DrinksPectinlyase0AspergillusE-DrinksProteaseAspergillusE+BakingRaffinase2MortierellaI-FoodYeastenzymes

Invertase6SaccharomycesI/E

-ConfectioneryLactase3KluyveromycesI/E-DairyLipaseCandidaE-FoodRaffinase2SaccharomycesI-Food微生物酶生产率提高的手段菌种选育 －－诱变育种发酵工艺优化－－发酵工程重组表达－－基因工程在张惠展教授课程基础上进一步提高分子生物学知识复习理论中心法则操纵子理论工具PCR限制性内切酶连接酶分子生物学知识复习

中心法则操纵子理论重组蛋白质表达载体必需元件选择标记启动子核糖体结合位点转录终止信号复制起点

(自主复制质粒必需)编码(c)DNA重组蛋白质的表达获取基因选择表达系统选择表达载体

基因克隆至表达载体

转化至表达宿主细胞筛选转化子

生长表达蛋白质克隆酶基因已知序列从文库中亚克隆(RT)PCR直接扩增化学合成未知序列联配同类酶的已发表序列，根据保守氨基酸序列设计简并引物扩增基因纯化酶，测定部分氨基酸序列，设计简并引物扩增基因以方法1，2设计DNA探针进行southern杂交和/或菌落杂交，筛选文库建立表达文库利用能表达酶活性的宿主菌的表型不同进行筛选纯化酶，制备抗体，用免疫印迹的方法筛选阳性克隆ModelPCRproductsshowingcombinationsofproteinexpressionmotifsrelativetothecloningsitesusedtoinsertthegeneintoanexpressionvector.PCRproductencodingaproteinwithaC-terminalepitope(forantibodydetectionorpurification)ortag(forpurification).PCRproductencodingaproteinwithanupstreamproteasesite(forremovalofanN-terminaltagderivedfromtheexpressionvector)andaC-terminalepitopeortag.PCRproductencodingaproteinsecretionsignalandaC-terminalepitopeortag.PCRproductencodingaproteinwithoutastopcodon,sothatavarietyofC-terminaltagscanbeaddedbytheexpressionvector.PCRproductencodingaproteinthatrequirestheexpressionvectortosupplyboththetranslationstartandstop(i.e.theproteinwillhaveextraaminoacidsfromtheexpressionvectoratboththeNandCtermini).Kz,Kozak;SD,Shine–Dalgarnosequence.CurrentOpinioninBiotechnology2006,17:359–366Typicalcombinationsofproteinexpressionelementsinexpressionvectors.AllexpressionvectorssupplyapromoterupstreamoftheN-terminalcloningsite,whichmayormaynotbecontrollable.TheN-andC-terminalcloningsitescanbeasinglesite.(a)ProvidesaC-terminalepitopetag.(b)ProvidesanN-terminaltranslationstartandaffinitytag.(c)Avectorsimilarto(b)butwiththepresenceofatoxicgenebetweenthecloningsitesforselectionagainstemptyvectormolecules(i.e.vectorsthatdonotcontainthegeneofinterest).(d)VectorcontainingaC-terminalfluorescentproteintag(e.g.greenfluorescentprotein)formakingfluorescentfusionproteins.drugR,drugresistancegene;ori,originofreplication.CurrentOpinioninBiotechnology2006,17:359–366

重组表达系统E.coli(T7,tac/trc,T5,ara…)BacillusPichiapastoris(aox1,gap)Aspergillusniger……BaculovirusCHO体外翻译系统蛋白质产量翻译后修饰加工，

折叠

(二硫键)和糖基化蛋白质纯化经济性可用设备表达系统选择考虑因素:首选重组蛋白质表达系统－－大肠杆菌生长最快

实验操作最方便可高密度发酵遗传背景清楚

容易获得各种载体和宿主FactorsinfluencingrecombinantproteinproductioninE.coliMergulhaoetalJournalMicrobiolBiotechnology2004

E.coli表达系统可用启动子列表常用大肠杆菌表达系统trc启动子pTrcHIS(Invitrogen)pKK223,pTrc99(Pharmacia)T7启动子pET(Novagen)pRSET,pCRT7(Invitrogen)araBAD启动子pBAD(Invitrogen)T5启动子pQE系列(Qiagen)首选中的首选--pET系统T7表达系统工作原理pET表达流程pETVectorCharacteristicsTable以pET24开始

利用增溶标签

进行蛋白质

重组表达和纯化MBP作为增溶标签的优越性KataevaI,ChangJ,XuH,LuanCH,ZhouJ,UverskyVN,LinD,HoranyiP,LiuZJ,LjungdahlLGetal.:ImprovingsolubilityofShewanellaoneidensisMR-1andClostridiumthermocellumJW-20proteinsexpressedintoEscherichiacoli.JProteomeRes2005,4:1942-1951. Resultsfromahigh-throughputstructuralgenomicsprojectcomparingMBP,GST,NusAandHis6solubilitytags.Thestudyof152proteinsfrommesophilicandthermophilicbacteriasuggestedthatMBPwasthebesttagformakingsolublefusions,andalsoshowedthepositiveeffectofloweredexpressiontemperatureonsolubility.Theauthorsdiscussalgorithmsforpredictingthesolubilityofproteins.DysonMR,ShadboltSP,VincentKJ,PereraRL,McCaffertyJ:ProductionofsolublemammalianproteinsinEscherichiacoli:identificationofproteinfeaturesthatcorrelatewithsuccessfulexpression.BMCBiotechnol2004,4:32. Theauthorschose30diversehumangenesandcomparedexpressionwithsixdifferentN-terminalandeightdifferentC-terminalsolubilityfusions.ResultsshowedthatMBPandTrxwerethebesttagsandthatMBPalsoworkedasaC-terminalfusion,contrarytopreviousresults.Theauthorsnicelyhighlighttheproteinfeaturesthatseemtocorrelatewithsolubility:molecularweight,numberofhydrophobicresidues,andlowcomplexityregions.BussoD,Delagoutte-BussoB,MorasD:Constructionofasetgateway-baseddestinationvectorsforhigh-throughputcloningandexpressionscreeninginEscherichiacoli.AnalBiochem2005,343:313-321. Thisarticledescribestheconstructionof10recombinationalcloningvectorsandtheiruseforcomparingexpressionandsolubilityofasmallnumberofgenesfromBacillussubtilis.MethodsforgeneratingandtestingnewvectorsareclearlydiscussedandtheresultsofthesolubilityanalysissuggestthatMBPandNusAaremuchbetterthanGSTorTrxinthecaseofthesepartnerproteins.大肠杆菌表达实验策略首选pET系统,如pET24/BL21(DE3)1mMIPTG诱导无表达?

融合表达，T5,pBAD系统包涵体？IPTG浓度(1uM,10uM,100uM)，降温低至18℃LB

TB培养基与MBP融合表达共表达分子伴侣改善可溶性定向进化重组表达制备有功能的蛋白质参考文献报道改变诱导条件（温度，诱导剂的量）增溶标签（MBP)改换表达载体，如不同的启动子分子伴侣根据基因来源，考虑所使用的表达宿主及载体包涵体纯化定向进化大肠杆菌表达系统小结优点最方便，最有效缺点分泌表达能力弱二硫键形成困难无翻译后修饰酵母表达系统(Invitrogen)PichiaExpressionKitsPichiapastoris

简介BuddingPichiapastoris醇氧化酶的催化场所––––过氧化物酶体可占到细胞总体积的80%无快速碳源而含有甲醇，产生醇氧化酶能占到细胞总蛋白的30%Pichiapastoris表达体系的优点外源基因稳定整合醇氧化酶基因的启动子强，且可用甲醇严格调控表达重组蛋白质可以以胞内或胞外形式表达含有真核表达系统共有的翻译后修饰功能有商品化宿主/载体，操作简便放大方便，发酵密度极高TypicalPichiapastorisexpressionvector

5’AOX1:AOX15’regionincludingpromoterMCS:MultiplecloningsiteTT:AOX1terminatorHIS4:histidinoldehydrogenase3’AOX1:AOX13’regionAmp:Ampicillin-resistancemarkerfiori:f1bacteriophageorigin.Sig:signalsequencesSacI,SalI,StuIandBglIIcuttingsiteareusedtolinearizethevectorbeforetransformationPromotoraox1启动子：强启动子甲醇诱导葡萄糖，甘油等快速碳源阻遏表达调控技术较成熟gap启动子组成型强启动子葡萄糖 强启动子甘油 中等强启动子甲醇 弱启动子Pichiapastorisstrains

StrainGenotypeApplicationX33Wild-typeSelectionofZeocin-resistantexpressionvectorsGS115his4SelectionofHIS4expressionvectorsKM71his4,aox1::ARG4;arg4SelectionofHIS4expressionvectorstogeneratestrainswithMutSphenotypeKM71Haox1::ARG4;arg4SelectionofZeocin-resistantexpressionvectorstogeneratestrainswithMutSphenotypeSMD1165his4prB1SelectionofHIS4expressionvectorstogeneratestrainswithoutproteinBactivitySMD1168his4pep4SelectionofHIS4expressionvectorstogeneratestrainswithoutproteaseAactivitySMD1163his4pep4prB1SelectionofHIS4expressionvectorstogeneratestrainswithoutproteaseAandproteaseBactivitySMD1168Hpep4SelectionofZeocin-resistantexpressionvectorstogeneratestrainswithoutproteaseAPichiapastoris表达实验流程电转化GS115初筛(50ml离心管)

有表达

复筛(250ml摇瓶)

发酵罐无表达

以pPIC3.5K尝试胞内表达外源基因克隆到pPIC9的alpha信号肽序列之后Pichiapastoris表达系统小结优点有商品化宿主/载体，操作简便真核表达系统重组蛋白质可以以胞内或胞外形式表达高密度发酵方便有翻译后加工缺点翻译后加工形式有独特性重组酶表达小结首选文献报道表达系统次选大肠杆菌大肠杆菌中无活性选用酵母系统根据基因来源定表达系统芽孢杆菌放线菌酵母霉菌基因加亲和标签便于纯化酶制备流程图细胞破碎手段超声波目前只用于实验室或小规模高压匀浆机(highpressurehomogenizer)珠磨机(beadmills)freeze-presses小规模渗透压冲击法自发分解(yeast,Bacillus)酶裂解(溶菌酶，Lyticase,Zymolase,蜗牛酶)细胞破碎需考虑因素HeatAllmechanicalmethodsrequirealargeinputofenergy,generatingheat.Coolingisessentialformostenzymes.Thepresenceofsubstrates,substrateanaloguesorpolyolsmayalsohelpstabilisetheenzyme.ShearShearforcesareneededtodisruptcellsandmaydamageenzymes,particularlyinthepresenceofheavymetalionsand/oranairinterface.ProteasesDisruptionofcellswillinevitablyreleasedegradativeenzymeswhichmaycauseseriouslossofenzymeactivity.Suchactionmaybeminimisedbyincreasedspeedofprocessingwithasmuchcoolingaspossible.Thismaybeimprovedbythepresenceofanexcessofalternativesubstrates(e.g.inexpensiveprotein)orinhibitorsintheextractionmedium.pHBufferedsolutionsmaybenecessary.Thepresenceofsubstrates,substrateanaloguesorpolyolsmayalsohelpstabilisetheenzyme.ChemicalSomeenzymesmaysufferconformationalchangesinthepresenceofdetergentand/orsolvents.Polyphenolicsderivedfromplantsarepotentinhibitorsofenzymes.Thisproblemmaybeovercomebytheuseofadsorbents,suchaspolyvinylpyrrolidone,andbytheuseofascorbicacidtoreducepolyphenoloxidaseaction.OxidationReducingagents(e.g.ascorbicacid,mercaptoethanolanddithiothreitol)maybenecessary.Foaming

Thegas-liquidphaseinterfacespresentinfoamsmaydisruptenzymeconformation.

Heavy-metaltoxicityHeavymetalions(e.g.iron,copperandnickel)maybeintroducedbyleachingfromthehomogenisationapparatus.Enzymesmaybeprotectedfromirreversibleinactivationbytheuseofchelatingreagents,suchasEDTA.Manton-Gaulin匀浆机从澄清液中提取酶超滤硫酸铵沉淀有机溶剂沉淀热处理浓缩去不耐热的杂蛋白胞内酶纯化

去除核酸非特异性

硫酸铵沉淀特异性带正电荷材料

(与核酸带负电的磷酸基团作用形成复合物)聚乙烯亚胺，阴离子洗涤剂十六烷基三乙基溴化铵，硫酸链霉素，硫酸鱼精蛋白牛胰核酸酶色谱（层析）离子交换色谱吸附色谱亲和色谱疏水色谱凝胶排阻色谱（分子筛）酶制剂使用添加剂共价修饰固定化小结酶的来源很多，但主要来源于微生物发酵酶的工业化应用取决于他们的效果，成本和安全性离心一般用于收集含酶固体

过滤更多用于液体酶回收

双水相体系将会在酶回收操作中得到更多应用制备工业用酶需尽量压缩分离提取步骤酶制剂必须稳定，使用安全固定化酶优点便于从反应体系中分离从而易于控制反应时间，减少酶失活可反复使用降低用酶成本提高酶稳定性缺点传质限制动力学性质发生变化固定化增加额外成本

a.吸附

b.共价连接

c.包埋

d.膜限制

酶的固定化方法多点作用使酶稳定化固定化酶方法比较Characteristics

Adsorption

Covalent

bindingEntrapmentMembraneconfinementPreparation

Simple

Difficult

Difficult

SimpleCost

Low

High

Moderate

HighBindingforce

VariableStrong

Weak

StrongEnzymeleakage

Yes

No

Yes

NoApplicability

Wide

Selective

Wide

VerywideRunningProblems

High

Low

High

HighMatrixeffects

Yes

Yes

Yes

NoLargediffusionalbarriers

No

No

Yes

YesMicrobialprotection

No

No

Yes

Yes

固定化载体EupergitC®Sepabeads®series新型固定化方法—无载体固定化Thedifferentapproachestotheproductionofcarrier-freeimmobilisedenzymes:crystallization;(b)aggregation;(c)spray-drying;(d)directcross-linking.AGG,aggregates;CRY,crystals;SDE,spray-driedenzyme.固定化酶小结酶的固定化使得它们能高效和连续使用酶的固定化形式有4种酶的固定化影响动力学性质酶的固定化一般可提高其使用的经济性酶的固定化新技术－－无载体固定化酶反应器图解基础篇小结重组微生物是酶的最重要来源工业用酶的分离提取对成本敏感固定化酶是工业用酶制剂的重要形式酶反应器对于发挥酶的催化作用也很重要提高篇酶的改造获得新酶的途径自然界中获取有理设计新酶随机方法筛选新酶酶的设计方法无理设计天然设计有理设计基于功能--生物多样性与新酶的发现嗜热菌（Thermophiles)嗜冷菌（Phyphophiles)嗜酸菌（Acidophiles)嗜碱菌（Alkaliphiles)嗜盐菌（Halophiles)嗜压菌（Barophiles)

极端微生物的特殊生长环境及代谢产物，使酶在“恶劣”环境下能够发挥高效催化作用。基于序列--目前已经有无数的基因组被测序/sites/genomeSαIβDistributionforpenicillinGacylasePGAprecursorstructure天然酶化学

-转化天然底物物理 -耐受差生物 -代谢调控和高转换数环境不同要求不同自然进化中天然酶的结构功能对应于其活细胞的生理功能而进化的天然酶往往不适用于生物技术应用改造目的高专一性

只催化所需反应

减少甚至没有副产物高活性高生产率不易受抑制高稳定性

存放时间长操作稳定性高生物催化剂应用依赖于天然酶改造或重新设计方法酶的改造蛋白质工程－－理性设计

通过蛋白质化学、蛋白质晶体学和动力学的研究获取关于蛋白质物理、化学等方面的信息，在此基础上对编码该蛋白的基因进行有目的的设计改造，并通过基因工程等手段将其进行表达和分离纯化，最终将其投入实际应用。基因工程，结构生物学和生物信息学化学修饰固定化诱变筛选－－无理设计Timeline|20yearsofproteinengineeringJamesA.BranniganandAnthonyJ.Wilkinson.Proteinengineering20yearson.

NatureReviewsMolecularCellBiology2002,3,964-70CDR,complementarity-determiningregions:TyrRS,tyrosyl-tRNAsynthetase分子生物学知识复习

中心法则蛋白质功能＝f(蛋白质序列)

改变序列影响蛋白质功能(c)DNA序列蛋白质序列立体结构功能蛋白质序列空间a表示最小蛋白质的氨基酸残基数，b表示最大蛋白质的氨基酸残基数。n个氨基酸残基组成的线性长链的序列空间为20n所有蛋白质都可以表示为这个b维空间的唯一一点，比如枯草芽孢杆菌蛋白酶BPN’坐标为（A,Q,S,V,P,Y,G,V,S,Q,I,K,A,…,A,Q,0,…,0,0,0）。小至100个氨基酸残基组成的酶的序列空间也大至20100序列空间蛋白质特性序列空间距离近蛋白质性质接近PAM250氨基酸相对突变率矩阵

和

基本氨基酸性质关系venn图有理设计根据详尽的结构功能关系知识结构一级结构 氨基酸顺序二级结构 a-螺旋,b-折叠,转角,无规卷曲三级结构 3D折叠(结晶，NMR)功能活性位点 氨基酸残基和辅因子催化 机理,

特异性和动力学调节 竞争性抑制和变构控制

怎么获得这些信息？经典途径纯化目标酶，分析氨基酸序列分离基因并重组表达结晶目标酶，X射线分析Copyrightrestrictionsmayapply.Chang,A.etal.Nucl.AcidsRes.200937:D588-D592;doi:10.1093/nar/gkn820Inputdataandtheirsourcedatabasesusedfortheco-occurencebasedtext-miningapproachthatgeneratestheBRENDAsupplementsFRENDAandAMENDA序列与结构分析多重联配 序列保守性信息结晶/同源模建 获得立体结构三维结构分析 分子图像分析多重联配

ClustalWCrystals:18%PEG6K,0.1MBicine,pH8.5,0.01MCdCl2.StructuralstudiesofD-hydantoinasefromBurkholderiapickettiiSummaryofpurificationofDHasefromE.coliBL21(DE3)/pXZPH2PurificationstepSamplevol(ml)Totalprotein(mg)Totalactivity(U)Spact(U/mg)PurificationfactorActivityyield(%)Cellextract25.060030.80.051.0100Ni2+chelateaffinitycolumn

4.04.45.01.1322.616.6ARibbondiagramshowingtheoverallstructureofDHasemonomerandtetramerviewedfromthecatalyticactivesite.XuZetalJournalofBacteriology2003PyMOL:Itcanproducehighquality3DimagesofsmallmoleculesandbiologicalmacromoleculesMVD蛋白质与配体分子对接分析HIV-1proteaseXK263PDBID:1HVR文件格式：PDB、Mol2、SDF等预测活性中心Docking配体与蛋白质间氢键有理设计目标催化效率稳定性热稳定性有机溶剂稳定性pH曲线提高热稳定性的重要全局性因素环区长度减少以及随之而来的二级结构增加表面电荷相互作用敏感氨基酸残基减少

(如半胱氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺)芳香环堆积增加疏水作用增加金属离子结合能力提高寡聚增加JasonKYanoandThomasLPoulos.Newunderstandingofthermostableandpeizostable

enzymes.CurrentopinioninBiotechnology,2003,14:1-6

常用提高稳定性方法 引入二硫键和/或盐桥CCOOCCOOCCOOCCOOCCOOIndex1Index2Index3Index40<OSP<0.150.15<OSP<0.300.30<OSP<0.450.45<OSP<0.600.60<OSP<0.75FullyexposedstateExposedstateBoundarystateBuriedstateWell-buriedstateIndex5氨基酸残基分布差异高

PRO

低

MET

低极显著低低SER

（低）低（低）ASN高

TYR高

TRP

低LYS

高极显著

高

GLU

高

高

ARG

高ILE

低

VAL高极显著

低极显著

ALA完全包埋包埋部分包埋/部分暴露暴露完全暴露

对于热稳定性改造的具体指导完全暴露

SER,LYS

ILE

暴露

ALA,VAL,ASN,SER

ARG,GLU

部分包埋/部分暴露SER

?

包埋： MET

ARG,GLU

完全包埋： ?

ALA,TRP,TYR,PRO

pH曲线的改变将蛋白质表面变得更带负电荷将提高酸性基团的pKa值，因为它们在离子化时丢失质子。反之，将表面变得更带正电荷则降低所有酸性基团的pKa值。低离子强度时变化将最大如果避免多电荷抗衡离子，当离子强度高至0.1M时会出现明显的变化。突变设计应避免在活性中心空穴附近聚集抗衡离子。RussellandFersht.Rationalmodificationofenzymecatalysisbyengineeringsurfacecharge.

Nature,1987,328(6),496-500融合蛋白质－－广义的有理设计组氨酸标签(Histidine-tag,his-tag)谷胱甘肽合成酶

(glutathionesynthetase,GST)麦芽糖结合蛋白质

(maltosebindingprotein,MBP)内含肽(Intein)各种信号肽改善重组蛋白可溶性，便于亲和层析纯化。。。PCR原理定向突变

-PCRStratageneMutagenesisKitSelectionGuide两种定点突变方法的比较有理设计小结工具酶数据库 Brenda序列联配 ClustalW同源模建 Swissmodel分子图像 Rasmol定点突变，序列重组 PCR目标热稳定性，pH曲线 表面氨基酸替换催化效率需了解催化机理底物特异性 需了解催化机理生物催化剂的定向进化高频随机突变导入方法DNA聚合酶 碱基错配率/每轮复制大肠杆菌体内 1 X10-10-10-8Replicase 1.03 X10-4Vent(exo-) 1.9 X10-4Taq 2.0-21 X10-5KlenTaq 5.1 X10-5Vent 2.4-5.7 X10-5Pfu,PfuTurbo 1.6 X10-6

易错PCRerror-pronePCR(=PCRwithmanyerrors/mutations)

无校对DNA聚合酶 e.g.Taq,Mutazyme

非优化条件 e.g.Mn2+代替Mg2+,调整4种dNTP相对浓度RandomMutagenesiskit突变率0.1－1.6%/PCR,相当于1－7个碱基突变/基因高频随机突变导入方法以大肠杆菌XL1-Red作为基因复制宿主

MutantsoftheP.furioususAlkalinePhosphataseGene:MorphologyofclonesonLBplatescontainingBCIPindictorsubstrate.A:ParentPfualkalinephosphataseclone.B:Pfu5.C:Pfu5-1.D:Pfu5-2.XL1-Bluestrain:recA1endA1gyrA96thi-1hsdR17supE44relA1lac[F'proABlacIqZΔM15Tn10(Tetr)]

正常菌株XL1-Redstrain:endA1gyrA96thi-1hsdR17supE44relA1lacmutD5mutSmutTTn10(Tetr)

DNA修复缺陷

Greener,A.andCallahan,M.

(1994),Strategies.

7:32-34

培养到平台期平均2Kb发生1个碱基突变逐点饱和突变技术逐点饱和突变技术定向进化提高枯草芽孢杆菌蛋白酶E在DMF水溶液的活力ChenandArnold.PNAS1993YouandArnold.ProteinEng1996进化

逐步过程自然进化

自发突变

重组

自然选择达尔文进化理论

生命的复杂性是突变，重组和自然选择算法的结果人类的作物，花卉和家禽家畜育种实践有几千年历史加速进化

快速改变农业进化

自发突变

育种

筛选革命

极快改变实验室进化

加快突变速度 分子育种

筛选实验室进化不同于自然进化在于其明确的进化目标.在此意义上它是“定向”并且更像育种。此外，它非常快。加速进化

快速改变农业进化

自发突变

育种

筛选革命

极快改变实验室进化

加快突变速度

分子育种

筛选进化

逐步过程自然进化

自发突变

重组

自然选择DNAshufflingscreenandselect*

**

*

**

PCRDNaseI*

**

*

PCR*

**

**

libraryDenature&anneal5’5’***Homo-duplexformation5’5’**5’5’**5’3’3’5’**fillin&lify**Error-pronePCRDNAShufflingDNAshuffling–β-lactamasecaseβ-Lactamase:hydrolysisofbeta-lactamantibioticsβ-lactamaseAmpicillinCefotaximedegrade(Stemmer,W.P.C.Nature1994370:389-391)TEM-1W.T.shuffling-3cycleBackcrossover-2cycleX16,000X32,000MIC=0.02ug/mlMIC=640ug/mlperiplasm定向进化方法比较Accumulationofmutationsbysequentialmutagenesis,

pairwiserecombinationandpoolwiserecombination

单基因Shuffling和多基因Shuffling获得的突变库DNAFamilyshufflingParentalSequencesRandomFragmentationDenaturizationAnnealingExtentionFinalLibrarycrossoverRepeatedCyclesofPrimerlessPCR

定向进化的基本过程SinglegeneDNAshufflingMultiplegenesDNAfamilyshufflingExpressionandscreenRepeatedasneededComparisonofsinglesequenceshufflingversussequencefamilyshufflingStaggeredExtensionProcess(StEP)DenaturationAnnealing,

ExtensionDNADNADenaturationAnnealing,

ExtensionRACHITT示意图两种野生型基因A和B双链DNA处理成单链DNA。DNaseI处理单链DNA，形成许多的随机大小的片段。随机片段与单链模板杂交。通过两端引物的PCR扩增反应得到具有目的片段大小的杂合基因。14crossovervs1-4crossoverDNAshuffling-efficiencydependsonhomologyHomo-duplexformation5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’Hetero-duplexformation5’3’3’5’PCRPCRResemblessynthesisofsyntheticgene(DirectedMutagenesis)Resemblessynthesisofgenefusions(DirectedMutagenesis)IncrementalTruncationfortheCreationofHYbridenzymes

(ITCHY)

对随机挑选的混组酶进行测序证明ITCHY比普通混组方法在两个基因的非同源区发生了更多的交叉。而且通过ITCHY发现的嵌合酶比普通DNA混组方法获得杂合酶的活性相同或更高。

SequenceHomology-Independent

ProteinRecombination(SHIPREC)应用于膜结合人细胞色素P450和可溶性细菌P450亚铁血红素结构域的混组，将混组基因库和氯霉素乙酰基转移酶基因融合，筛选到2个在细菌中可溶性比人P450高的P450杂合酶。

error-pronePCR2-6nucleotidemutations/DNAmolecule1-3aminoacidsubstitutions/proteinmoleculeDNAshufflinghighhomologyatDNAlevel(>60%identity)

-fragmentationbyDNase(multiplerecombination) -restrictionenzymes(multiplerecombination)lowhomologyatDNAlevel

-domainswapping(single-siterecombination;ITCHY) -shufflingof“syntheticgenes”(multiplerecombination)实验室进化-进化方法比较

高通量筛选－－无理设计的有理部分selection选择screening筛选ImagingPolarimetryforHighThroughputChiralScreeningPhillipR.Gibbs,ChristianS.Uehara,PeterT.Nguyen,andRichardC.WillsonBiotechnol.Prog.19,13