高效液相色谱分析(福建师范大学)

第三章

高效液相色谱分析highperformanceliquidchromatograph2024/5/16教学目标及要求：1.掌握液相色谱的特点；2.掌握液相色谱法的分类；3.了解影响液相色谱峰扩展及色谱别离的因素；4.理解液相色谱别离的原理；5.了解液相色谱的固定相和流动相；6.了解液相色谱仪的组成和结构原理及主要部件；7.了解液相色谱别离类型的选择；8.了解液相色谱的应用。教学重点、教学难点：1.高效液相色谱与气相色谱的异同点

2.高效液相色谱速率理论方程式在实验条件优化中的应用

3.别离柱和流动相的选择和匹配

4.不同种类液相色谱别离的原理上的差异2024/5/16第一节

高效液相色谱法概述Generalizationofhighperformanceliquidchromatograph一、概述Generalization二、高效液相色谱仪HPLC三、高效液相色谱法的特点featureofHPLC四、流程及主要部件generalprocessandmainassemblyofHPLC2024/5/16高效液相色谱法：以液体作为流动相的色谱法。它是在经典液相色谱实验根底上，引入气相色谱的理论，在技术上采用高压输液泵，高效固定相和高灵敏的检测器，而开展起来的快速别离分析技术。具有别离效能高，检出限低，操作自动化和应用范围广的特点。一、概述Generalization2024/5/16(一)、HPLC与经典LC区别经典液相色谱高效液相色谱

常压或减压

填料颗粒大

柱效低

分析速度慢

色谱柱只用一次不能在线检测

高压，40～50MPa

填料颗粒小，2～50μm

柱效高,40000～60000块/m

分析速度快

色谱柱可重复多次使用

能在线检测2024/5/16(二)、HPLC与GC异同点气相色谱高效液相色谱只能分析挥发性物质，只能分析20%的化合物不能用于热不稳定物质的分析用毛细管色谱可得到很高的柱效有很灵敏的检测器如ECD和较灵敏的通用检测器（FID和TCD）流动相为气体，无毒，易于处理运行和操作容易仪器制造难度较小几乎可以分析各种物质

可以用于热不稳定物质的分析色谱柱不能很长，柱效不会很高没有较高灵敏的通用检测器①

流动相有毒，费用较高运行和操作比GC难一些仪器制造难度大①近来出现的蒸发激光光散射检测器〔ELSD〕是灵敏度较高的通用检测器2024/5/16流动相差异GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用。HPLC：流动相为液体组分与流动相和固定间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善别离度增加了因素，对别离起很大作用。流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对别离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大别离选择性操作条件差异GC：加温操作HPLC：室温；高压〔液体粘度大，峰展宽小〕2024/5/16二、液相色谱仪器

highperformanceliquidchromatograph2003年全球液相色谱市场的总销售额为25.16亿美金，2021年预计将到达33.83亿美金。国内对液相色谱仪的需求量越来越大：2000年版中国药典规定用液相色谱仪对药物的最终质量控制和检验，较之95版药典有了大幅度的增加；我国的医药生产、新药开发以及中草药的研究都大大增加了对液相色谱的需求；色谱分析已被列为全国化学及相关专业大学生的必修课，全国近1000所大学学生实验用液相色谱仪的需求量将相当可观；随着国家对环境保护和生态平衡的更加重视，“十五〞期间全国各地的环境监测站也已逐步配备液相色谱仪及其他分析仪器，对水质、大气和土壤进行监控；我国进出口国际贸易近年来快速增长，并还将持续大幅度增长，而色谱分析方法及其色谱—质谱联用技术是世界公认的商品检验手段之一，只有高质量的色谱仪、色质联用仪和高水平的检验结果才可能被世界各国认可，没有足够数量的高质量色谱仪器和色质联用仪就难以“与世界接轨〞。我国液相色谱仪的开展远远落后于气相色谱仪的开展，目前国内使用的液相色谱仪90%以上均是进口产品。——2004年市场调查报告2024/5/16液相色谱仪〔1〕2024/5/16液相色谱仪〔2〕2024/5/16液相色谱仪〔3〕2024/5/16液相色谱仪〔4〕2024/5/16美.瓦里安

Prostar210高效液相色谱仪2024/5/16三、高效液相色谱法的特点和应用特点：“三高〞“一快〞“一广〞高柱效——n=104片/米，柱效高〔远高于一般LC〕高灵敏度(紫外：10-9g；荧光：10-11g)高选择性分析速度快(＜1h)应用范围广泛〔可分析80%有机化合物〕〔是高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效别离分析方法。〕2024/5/16四、流程及主要部件

processandmainassemblyofHPLC1.流程液相色谱流程图PUMPDetectorWDatastation(Recorder)orCollection2024/5/162.主要部件P83(1)高压输液泵主要部件之一，压力：150～350×105Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相〔<10μm〕，液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀往复式柱塞泵死体积小，很适用于梯度洗提等特性。2024/5/16(2)梯度淋洗装置外梯度:〔低压梯度〕将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度：〔高压梯度〕一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。2024/5/162024/5/16(3)进样装置流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如下图：装入样品出口进样采样环泵入溶剂进色谱柱2024/5/16(4)高效别离柱柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。开展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。2024/5/16理想的HPLC检测器应具有如下特性：

第一，具有高灵敏度和可预测的响应；第二，对样品所有组分都有响应，或具有可预测的特异性，适用范围广；第三，温度和洗脱液流速的变化对响应没有影响；第四，响应与洗脱液组成无关，因此可作梯度洗脱；第五，死体积小，不造成柱外谱带扩展；第六，使用方便、可靠、耐用，易清洗和检修；第七，响应值随样品组分量的增加而线性增加，线性范围宽；第八，不破坏样品组分；第九，能对被检测的峰提供定性和定量信息；第十，响应时间快。(5)液相色谱检测器2024/5/16分类标准种类响应原理特点常用类型按检测

器性质

或应用

范围分

类总体性能检测器响应值取决于流出物（包括样品和流动相）某些物理性质的总的变化的检测器有广泛的适用范围，基线噪音和漂移较大，灵敏度低，不适于痕量分析，不能用于梯度洗脱示差折光率检测器介电常数检测器电导检测器溶质性能检测器响应值取决于流动相中溶质的物理或化学特性的检测器检测灵敏度高，受操作条件和外界环境影响小，可用于梯度洗脱，应用范围受限制紫外-可见检测器荧光检测器化学发光检测器安培检测器手性检测器按测量

信号性

质分浓度敏感性检测器响应值正比于溶质在流动相中的浓度，测量的是流动相中溶质浓度瞬间的变化样品量一定时，检测器瞬间响应即峰高响应值和流动相流速无关，峰面积与流速成反比，峰面积与流速乘积为常数大部分常用的液相色谱检测器都属于该类检测器质量敏感性检测器响应值正比于单位时间内通过检测器的物质的质量即正比于质量流速峰面积与流动相流速无关，峰响应值与流速成正比库仑检测器检测器的分类：2024/5/16按

测

量

原

理

分光学性质检测器根据被测物质对光的吸收、发射和散射等性质进行检测的应用范围广，灵敏度高紫外-可见检测器，示差折光率检测器，蒸发光散射检测器，荧光检测器，化学发光检测器，手性检测器电学及电化学性质检测器根据被测物电化学性质进行检测

安培检测器，电导检测器，库仑检测器，介电常数检测器，极谱检测器热学性质检测器利用热学原理进行检测

光声检测器，热透镜和光热偏转检测器按信号

记录方

式分积分型检测器显示的信号是指在给定时间内物质通过检测器的总量灵敏度低，定性困难，应用少

微分型检测器显示的信号表示在给定时间内每一瞬间时通过检测器的量灵敏度高

2024/5/16a.紫外检测器应用最广，对大局部有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小〔1mm×10mm，容积8μL〕；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。

2024/5/16b.光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如下图。2024/5/162024/5/16光电二极管阵列检测器2024/5/16c.示差折光检测器

〔differentialrefractiveindexdetector〕

除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；通用型检测器〔每种物质具有不同的折光指数〕；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干预型三种；2024/5/16示差折光检测器2024/5/16d.荧光检测器

〔fluorescencedetector〕高灵敏度、高选择性的检测器。对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；e.其它检测器：

电化学检测器(电导检测器、伏安检测器等)

电导检测器直接测定柱后洗脱液的电导变化。将被测洗脱液置于施加电场的两个电极间，电导值1／R〔R为两电极间电阻值〕与电极截面积A，两电极间距离L和各离子的电导总和∑Cⅰλⅰ之间有如下关系:

式中Cⅰ为i离子的摩尔浓度，λⅰ为i离子的摩尔电导。2024/5/16一、液-固吸附色谱liquid-solidadsorptionchromatograph二、液-液分配色谱liquid-liquidpartitionchromatograph三、离子交换色谱ion-exchangechromatograph四、离子色谱ionchromatograph五、离子对色谱ion-pairchromatograph六、排阻色谱size-exclusionchromatograph七、亲和色谱(AC)Affinity

chromatograph第二节

主要别离类型与原理P70basicprincipleandmainseparatingtypes2024/5/16一、液-固吸附色谱

liquid-solidadsorption

chromatography固定相：固体吸附剂：如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂，“相似相溶〞原理根本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于别离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有不同官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；2024/5/16二、液-液分配色谱

liquid-liquidpartition

chromatography固定相与流动相均为液体〔互不相溶〕；根本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性〔正相normalphase〕，别离极性化合物，极性小的先出峰。反之，流动相的极性大于固定液的极性〔反相reversephase〕。正相与反相的出峰顺序相反。

aqorgii

KiStationaryphaseMobilephase2024/5/16固定相有机基团主要有三类：

1.疏水基团:如不同链长的烷烃〔C8，C18，C6等〕。

2.极性基团：如丙胺基，氰乙基，醚和醇等。

3.离子交换基团：如作为阴离子交换基团的胺基，季铵盐。作为阳离子交换基团的磺酸基等。固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；

化学键合固定相：〔将各种不同基团通过化学反响键合到硅胶〔担体〕外表的游离羟基上)。2024/5/16三、离子交换色谱

ion-exchange

chromatography键合相离子交换剂是以硅胶为基质，在它上面覆盖一层如下图的离子交换树脂涂层，或者在硅胶上直接键合离子交换基团。固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；2024/5/16流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；根本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反响；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保存时间长。阳离子交换：阴离子交换：离子交换反响到达平衡时，保存值决定于平衡常数。容量因子k’与平衡常数K成正比，且与流动相中的反离子浓度〔M+、X-〕成反比。应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸、蛋白质等。2024/5/16四、离子色谱P74

ionchromatography

离子交换色谱法由于没有与之相匹配的检测器，难以发挥更大的作用。无机离子与大多数有机离子不同，只有在远紫外区才有吸收，光度检测器不适于检测无机离子，而电导检测器却是可检测电解质溶液的通用型检测器，这种检测器简单易于操作，但是长时间以来没有一种可以和电导检测器相适应的别离模式。直到1975年Small才提出把电导检测器用于离子交换色谱，他为了克服洗脱液中的离子对电导检测器的干扰。在分析柱和检测器之间增加一个“抑制柱〞，消除洗脱液中离子本身带来的本底电导，他把这一方法叫做“离子色谱〞〔IonChromtatography〕。这一方法提出之后受到普遍的重视，20多年来得到了长足的开展，成为分析无机和有机离子十分重要的方法，在各领域中得到广泛的应用。2024/5/16离子色谱仪2024/5/16离子色谱法原理

principleofIC(IonChromatography,简称IC)以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象,在七十年代出现、八十年代迅速开展。

传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：(1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；(2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。2024/5/16离子交换原理，与传统离子交换的不同点：采用交换容量非常低的特制离子交换树脂为固定相；细颗粒柱填料，高柱效；采用高压输液泵；低浓度淋洗液或本底电导抑制〔在别离柱后，采用抑制柱来消除淋洗液的高本底电导〕；可采用电导检测器，快速别离分析微量无机离子混合物；各种抑制装置及无抑制方法的出现，开展迅速。2024/5/16离子色谱具有以下优点〔1〕分析速度快可在数分钟内完成一个试样的分析；〔2〕别离能力高在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物别离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全别离。〔3〕别离混合阴离子的最有效方法〔4〕耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱2024/5/16离子色谱装置类型

suppressedapparatusofIC抑制型：抑制柱型、连续抑制型别离柱中离子交换树脂的交换容量通常在0.01～0.05毫摩尔/克干树脂。用NaOH洗脱，但高电导背景，灵敏度差增加抑制柱解决解决方法？2024/5/16抑制柱为高容量的强酸性阳离子交换剂。当试样经阴离子交换剂的别离往后，随流动相进入抑制柱，在抑制柱中发生两个重要反响：由反响可见：经抑制柱后，一方面将大量碱转变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品阴离子OH-转变成相应的酸，由于H+离子的淌度为Na+离子的7倍，提高了所测阴离子电导的检测灵敏度。对于阴离子样品也有相似的作用机理。淌度：在单位电场强度下,某种离子i在一定温度和一定介质中移动的速率2024/5/16离子色谱连续抑制装置图2024/5/16假设样品为阳离子，用无机酸作流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。当试样经阳离子交换剂的别离往后，随流动相进入抑制柱，在抑制柱中发生两个重要反响：由反响可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品阳离子M+转变成相应的碱，由于OH-离子的淌度为Cl-离子的2.6倍，提高了所测阳离子电导的检测灵敏度。对于阴离子样品也有相似的作用机理。2024/5/16在别离柱后加一个抑制柱的离子色谱亦称为抑制型离子色谱或称双柱离子色谱。由于抑制柱要定期再生，而且谱带在通过抑制柱后会加宽，降低了别离度。后来，Frits等人提出采用抑制柱的离子色谱体系，而采用了电导率极低的溶液，例如1×10-4～5×10-4mol·dm-3苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液作流动相，称为非抑制型离子色谱或单柱离子色谱。为了提高信噪比，洗脱液必须要用低电导物质，而且它的浓度要低，固定相的离子交换容量也降低，这样可使被测离子的保存时间在合理的范围之内。2024/5/16离子色谱连续抑制原理图非抑制型:当进一步降低别离柱中树脂的交换容量(0.007～0.07毫摩尔/克干树脂),使用低浓度、低电离度的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接与别离柱相连，不需抑制柱。2024/5/16离子色谱的应用

applicationofIC阴离子分析:双柱；薄壳型阴离子交换树脂别离柱(3×250mm),流动相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1Na2CO3，流量138mL/hr。七种阴离子在20分钟内根本上得到完全别离，各组分含量在3～50ppm。2024/5/16五、离子对色谱

ionpairchromatography原理：将一种〔或多种〕与溶质离子电荷相反的离子〔对离子或反离子〕加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；

图离子对色谱别离过程示意图2024/5/16阴离子别离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；阳离子别离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子B+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子A-进入流动相后，生成疏水性离子对B+A-后；在两相间分配。根据离子对生成反响式，平衡常数KAB可表示为:根据定义，溶质的分配系数:得：2024/5/16六、排阻色谱色谱

size-exclusionchromatography

固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小别离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过局部凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量别离2024/5/16排阻色谱示意图：M.W.tR2024/5/16M.W.tR2024/5/16M.W.tR2024/5/16M.W.tR2024/5/16M.W.tR2024/5/16七、亲和色谱(AC)

Affinitychromatograph原理：利用生物大分子和固定相外表存在的某种特异性亲和力，进行选择性别离。先在载体外表键合上一种具有一般反响性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保存。改变淋洗液后洗脱2024/5/16一、液相色谱固定相stationaryphaseofHPLC二、液相色谱流动相

mobilephaseofHPLC第四节

液相色谱的固定相与流动相stationaryphaseandmobilephaseofHPLC2024/5/16一、液相色谱固定相

stationaryphasesofLC1.液-液分配及离子对色谱别离固定相〔1〕全多孔型担体由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100μm的大颗粒，外表涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；〔2〕外表多孔型担体〔薄壳型微珠担体〕30～40μm的玻璃微球，外表附着一层厚度为1～2μm的多孔硅胶。外表积小，柱容量低；2024/5/16〔3〕化学键合固定相化学键合固定相:目前应用最广、性能最正确的固定相。制备键合固定相一般有如下几种途径：1.用醇或胺与硅醇基反响，形成≡Si—O—C硅氧碳键型和硅氮≡Si—N—C键型.本法的缺点是产物容易水解和醇发生交换反响，因此仅适用已枯燥的无水乙醇为流动相。2.用有机氯硅烷与硅醇反响，形成≡Si—O—Si—C硅氧硅碳键型.本法的最大优点是固定相的热稳定性好。不易吸水，耐有机溶剂。能在700C,pH=2-8正常工作，因此应用特别广泛。3.通过硅胶与卤代烷反响，形成≡Si—C硅碳键型2024/5/16硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—

C

稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广

2024/5/16化学键合固定相的特点〔1〕传质快，外表无深凹陷，比一般液体固定相传质快；〔2〕寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；〔3〕稳定性好，耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；〔4〕选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；〔5〕有利于梯度洗脱；存在着双重别离机制：(键合基团的覆盖率决定别离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；〔封尾〕2024/5/162.液-固吸附别离固定相

种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：5～10μm；

2024/5/163.离子交换色谱别离固定相结构类别：〔1〕薄壳型离子交换树脂薄壳玻璃珠为担体，外表涂约1%的离子交换树脂；〔2〕离子交换键合固定相薄壳键合型；微粒硅胶键合型〔键合离子交换基团〕树脂类别：〔1〕阳离子交换树脂〔强酸性、弱酸性〕〔2〕阴离子交换树脂〔强碱性、弱碱性〕2024/5/164.空间排阻别离固定相〔1〕软质凝胶葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相。适用于常压排阻别离。〔2〕半硬质凝胶苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂〔3〕硬质凝胶多孔硅胶、多孔玻珠等；化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。2024/5/16二、液相色谱的流动相

mobilephasesofLC1.流动相特性〔1〕液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分别离状况；〔2〕亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。〔3〕假设流动相的极性大于固定液的极性，那么称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型别离柱上的出峰顺序相反。2024/5/162.流动相类别按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进别离或调整出峰时间。2024/5/163.流动相选择在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配别离时：首先选择中等极性溶剂，假设组分的保存时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保存时间缩短。常用溶剂的极性顺序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)2024/5/164.选择流动相时应注意的几个问题〔1〕尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。〔2〕防止流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。〔3〕试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。〔4〕流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。选择高效液相中溶剂的示意图2024/5/16一、影响别离的因素factorsinfluencedseparation二、别离类型的选择choiceofseparationtypes三、液相色谱的应用applicationofHPLC四、液相制备色谱preparativeliquidchromatography第五节

影响别离的因素与操作条件的选择

factorsinfluencedseparationandchoiceofoperationcondition2024/5/16一、影响别离的因素

factorsinfluencedseparation影响别离的因素与提高柱效的途径在高效液相色谱中,液体的扩散系数仅为气体的万分之一，那么速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即：H=A+Cu故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如下图。2024/5/16

液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温改变淋洗液组成、极性是改善别离的最直接的因素。2024/5/162.流速流速大于0.5cm/s时,H～u曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整别离度和出峰时间的重要可选择参数。3.固定相及别离柱气相色谱中的固定液原那么上都可以用于液相色谱，其选用原那么与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，别离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。2024/5/16速率方程可简化为：

Dm、Ds—试样分子在流动相、固定液中的扩散系数

关键是将H变小，而H变小关键是使dp变小，df变小。因此采用3～5m固定相颗粒，且键合相层薄，因此df就小，由于H很小，n很多，R大改进，实现了高效。在别离良好的根底上，才可提高流动相线速，节省了分析时间，从而实现了高速别离。如何实现高速别离？2024/5/16影响色谱峰扩展的因素2024/5/16二、别离类型选择

choiceofseparationtypes2024/5/16三、HPLC的应用

applicationofHPLC

1.环境中有机氯农药残留量分析

固定相：薄壳型硅胶(37～50m)流动相：正己烷流速：1.5mL/min色谱柱：50cm2.5mm(内径)检测器：差示折光检测器2024/5/162.稠环芳烃的分析

稠环芳烃多为致癌物质。

固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水～100%甲醇线性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱温：50ºC柱压：70104Pa

检测器：紫外检测器2024/5/16四、制备型液相色谱

preparativeliquidchromatography获得高纯物质〔色谱纯〕的有效方法。半制备柱〔内径8mm，长度15～30cm〕，一次制备量０.1～１mg；1.色谱柱的柱容量〔柱负荷〕对分析柱：不影响柱效时的最大进样量；对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量；超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。2024/5/162.液相制备色谱的方法收集组分时，通常有以下情况：〔1〕可获得良好别离，主峰使用制备柱，超载提高效率；〔2〕两主成分之间的小组分；超载，别离切分使待别离组分成为主成分〔富集〕后，再次别离制备。2024/5/163.制备型液相色谱

制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。制备柱：内径20～50mm，柱长50cm。2024/5/16一、超临界流体色谱的特点与原理featureandprincipleofSFC二、超临界流体色谱仪的结构流程structureandgeneralprocessofSFC三、超临界流体色谱的应用applicationofSFC第七节

超临界色谱supercriticalfluidchromatograph,SFC2024/5/16一、超临界流体色谱的特点与原理

principleandcharacterofsupercriticalfluidchromatography1.概述超临界流体：在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。性质介于液体和气体之间。超临界流体色谱(SFC)，80年代快速开展，具有液相、气相色谱不具有的优点:〔1〕可处理高沸点、不挥发试样；〔2〕比LC有更高的柱效和别离效率。2024/5/162.超临界流体性质〔1〕性质介于液体和气体之间;具有气体的低黏度、液体的高密度，扩散系数位于两者之间。〔2〕可通过改变超临界流体的密度〔程序改变〕调节组分别离〔类似于气相色谱的程序升温，液相色谱中的梯度淋洗〕。超临界流体的密度与压力有关。2024/5/163.原理SFC的流动相：超临界流体；CO2、N2O、NH3SFC的固定相：固体吸附剂〔硅胶〕或键合到载体〔或毛细管壁〕上的高聚物；可使用液相色谱的柱填料。填充柱SFC和毛细管柱SFC；别离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而被别离；通过调节流动相的压力〔调节流动相的密度〕，调整组分保存值；2024/5/16压力效应：SFC的柱压降大〔比毛细管色谱大30倍〕，对别离有影响〔柱前端与柱尾端分配系数相差很大，产生压力效应〕；超临界流体的密度受压力在临界压力处最大，超过该点，影响小，超过临界压力20%，柱压降对别离的影响小；压力效应：在SFC中，压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗时间缩短。CO2流动相，当压力改变：7.0→9.0×106Pa，那么：C16H34的保存时间25min→5min。2024/5/16程

序

升

压2024/5/16HPLC与SFC

比较2024/5/16二、超临界流体色谱的结构与流程

instrument

structureandthegeneralprocessofSFC1.结构流程

2024/5/162.主要部件〔1〕SFC的高压泵无脉冲的注射泵；通过电子压力传感器和流量检测器，计算机控制流动相的密度和流量；〔2〕SFC的色谱柱和固定相可以采用液相色谱柱和交联毛细管柱；SFC的固定相：固体吸附剂〔硅胶〕或键合到载体〔或毛细管壁〕上的高聚物；专用的毛细管柱SFC；2024/5/16主要部件〔3〕流动相SFC的流动相：超临界流体；CO2、N2O、NH3CO2应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解性好，在紫外光区无吸收；缺点：极性太弱；加少量甲醇等改性；〔4〕检测器可采用液相色谱检测器，也可采用气相色谱的FID检测器2024/5/16三、超临界流体色谱的应用

applicationofSFC1.聚苯醚低聚物的分析色谱柱：10m×63μmi.d.

毛细管柱，固定相：键合二甲基聚硅氧烷；流动相：CO2；柱温：120

C；程序升压；2024/5/162.甘油三酸酯的分析四种组分仅双键数目和位置不同，难别离；色谱柱：DB-225SFC毛细管柱；流动相：CO2；从15MPa程序升压到27MPa；2.5hr完全别离。2024/5/16第七节毛细管电泳

〔Capillaryelectrophoresis，CE〕一、概述在外加电场的作用下，带电的胶体粒子或离子在分散的介质中作定向移动〔泳动〕的现象称为电泳。不同带电粒子由于荷电量不同，分子的大小不同，泳动的速度也就不同，因此、电泳是一种适合于带电胶体粒子和离子的别离分析技术。电泳现象：带电离子在电场作用下的迁移，速度电渗流现象：玻璃外表存在硅羟基,pH＞3时,形成双电层，在高电场的作用下引起柱中的溶液整体向负极移动，速度。2024/5/16别离过程

电场作用下，柱中出现：电泳现象和电渗流现象。带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流两种速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应的运动方向相反，时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。2024/5/16高效毛细管电泳仪器〔1〕2024/5/16高效毛细管电泳仪器〔2〕2024/5/16高效毛细管电泳仪器〔3〕2024/5/16三维毛细管电泳系统〔AgilentCE，美国Agilent公司〕高效毛细管电泳仪器〔4〕2024/5/16特点：使用散热效率很高的毛细管〔25~50μm〕可以减少电泳时产生的焦耳热而导致的区域展宽，因而可以采用较高的电压〔20~30kV〕，有利于获得很高的别离效率，每米塔板数可达几十万，高者可达106，分析时间一般小于30min，试样分析范围宽，检测限低。进样量少，可达nl级，极微量的成分也可检出，且样品无需进行复杂的前处理，就可别离分析。高分辨率：理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。高灵敏度：可检测出低至10-21mol/L浓度的物质。高分析速度：可在3分钟内别离30种阴离子；1.7分钟别离19种阳离子；4分钟可别离10种蛋白质.试样用量少：仅需几nL〔10-9L〕的试样仪器简单，操作本钱低：分析一个试样仅需几毫升流动液。2024/5/16应用范围：

在中、西药物等分析领域广泛地被应用，同时也广泛地向生命科学领域的各个方面渗透，大量用于氨基酸、蛋白质、肽、低聚核苷的别离，对糖蛋白、糖肽型化合物的研究也正在进行之中。其中生物碱、有机酸等所有带电或不带电的化合物均可进行定量检测,蛋白质、糖肽、糖蛋白那么可得到很好的别离分析。2024/5/16二、构造

主要包括高压电源、毛细管、检测器和贮液槽四个局部。2024/5/16三、CE的别离模式1、毛细管区带电泳〔capillaryzoneelectrophoresisCZE〕2、毛细管凝胶电泳〔capillarygelelectrophoresisCGE〕3、胶束电动力学毛细管电泳〔micellarelectrokineticcapillarychromatography，MECC或MEKC〕4、毛细管等电聚焦〔capillaryisoelectricfocusingCIEF〕5、毛细管等速电泳〔capillaryisotachoporesis，CITP〕6、毛细管电渗色谱〔capillaryelectroosmoticchromatography，CEC)种类较多，实际应用不多，多用于科学研究——主要原因重现性不高2024/5/162024/5/16第八节薄层色谱法TLC〔一〕概述1．定义：将固定相均匀涂布在外表光滑的平板上，形成薄层而进行色谱别离和分析的方法2．操作过程：铺板→活化→点样→展开→定位(定性)/洗脱(定量)3．别离机制：吸附〔分配，离子交换，空间排阻〕4．特点：分析快速、灵敏、显色方便5．应用：药物杂质检查、纯度测定2024/5/162024/5/16〔二〕定性参数1.比移值RfRf与K有关，即与组分性质〔溶解度〕以及薄层板和展开剂的性质有关色谱条件一定，Rf只与组分性质有关，是薄层色谱根本定性参数，说明组分的色谱保留行为。2024/5/161〕K↑大，Rf↓小2〕薄层板一定，对于极性组分展开剂极性↑大，Rf↑大〔容易洗脱〕展开剂极性↓小，Rf↓小〔不容易洗脱〕3〕Rf范围：0<Rf<1〔组分迁移速度和距离小于展开剂迁移速度和距离〕Rf=0.2——0.8〔常用〕0.3——0.5〔最正确〕2024/5/16参考物与被测组分在完全相同条件下展开，可以消除系统误差，大大提高重现性和可靠性；参考物可以是后参加纯物质，也可是样品中组分相比照移值Rs与组分、参考物性质及色谱条件有关，范围可以大于或小于12.相比照移值Rs2024/5/16〔三〕吸附剂的选择

根据被测物极性和吸附剂的吸附能力

被测物极性强——弱极性吸附剂

被测物极性弱——强极性吸附剂〔四〕展开剂的选择〔