【HPV基因检测技术探究进展综述8100字】

HPV基因检测技术研究进展综述目录TOC\o"1-2"\h\u2107HPV基因检测技术研究进展综述 113649关键词：宫颈癌筛查；HPV基因检测；细胞学检测 180001HPV及其致病机制 139171.1HPV概述 1289981.2HPV流行病学 2168801.3HPV致病机制 213792HPV基因检测技术及其研究进展 338762.1细胞学检测方法 4225972.2基于DNA检测方法 4249952.3基于RNA检测方法 539603HPV预防与宫颈癌治疗 5326684前景展望 631735参考文献： 7摘要：宫颈癌是威胁世界女性健康的第四大恶性肿瘤，近年来，它的高发病率及越来越年轻化的趋势引起了人们的重视。目前预防宫颈癌发生的重点是宫颈癌的早期筛查，筛查目标在于识别和治疗宫颈癌的先兆病变，并且要准确、高效的识别这种宫颈异常病变。目前宫颈癌筛查方法种类较多，HPV基因检测技术是目前比较安全可靠的筛查选择。目前比较前沿的的几种HPV检测技术，不但检测率高，而且安全性也很好，但都各自存在着一定的局限性。本综述将全面阐述HPV基因检测技术的发展，以更好地辅助其应于临床治疗。关键词：宫颈癌筛查；HPV基因检测；细胞学检测子宫颈癌在威胁世界女性健康的恶性肿瘤中排第四位[1]，其发病率仅次于乳腺癌，严重威胁着全球女性的生命健康。近年来，子宫颈癌日趋年轻化的发病趋势越来越引起人们的关注。而目前在我国，子宫颈癌的发病率逐年呈现上升趋势。子宫颈癌的发生源自子宫颈上皮内瘤变[2-4](CervicalIntraepithelialNeoplasia，CIN)，为尽早发现无症状女性的高级别病灶，需要进行相关宫颈癌筛查，以防止其发展为浸润性疾病。而HPV基因检测技术的相关研究是进行宫颈癌筛查的实施手段，需要相关科研人员加以重视，那么本文就将对HPV基因检测技术及其研究进展加以综述，希望能为后面医务人员的研究提供便利。1HPV及其致病机制1.1HPV概述HPV（人乳头瘤病毒）是球形无包膜的小型环状双链DNA病毒，生物学分类上属于乳头瘤病毒科乳头瘤病毒属。截止目前，研究人员已经分离鉴定的HPV有200多个型别，根据其致病性的差别可以将其分为高危型和低危型。高危人乳头瘤病毒和宫颈癌的发生密切相关，除此之外还与宫颈癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌、肛门癌、复发性呼吸道乳头状瘤病等以及某些头颈部恶性肿瘤相关。主要的传播方式是性传播［5］，在发生性行为后，男性生殖器感染HPV的概率比女性要高，但因HPV持续存在的几率较小而罹患癌症风险极低，但是由于女性宫颈和阴道的生理结构，病毒更易滋生，因此相较于男性更易感染HPV，女性在HPV感染后的临床症状表现为宫颈部位发生病变，如阴道分泌物增多、不规则出血、宫颈糜烂以及下腹部疼痛等［6］。根据全球妇科癌症发病率统计，宫颈癌在其中排第四，此外值得注意的是，其中超过2/3的患者来自于南非以及拉丁美洲等欠发达地区［7］。1.2HPV流行病学HPV是比较常见的DNA病毒，在人群中的传播十分广泛。由于其存在自限性，大多数HPV感染并不会引起相应症状。因此其流行病学了解起来难以全面。截至目前的流行病学研究显示，人类对于多种型别HPV普遍易感，且性行为较活跃的年轻人群感染HPV的几率最大。目前主要传染源来自HPV患者及其携带者，主要传播途径是性接触。近几年，HPV感染率明显增加，且呈现明显上升态势，并且在年轻人群中表现尤为明显。中国上世纪70年代至今的全国死因调查研究显示，2004-2005年中国女性宫颈癌的病死人数在女性癌症患者病死人数中占比较之于1990-1992年和1973-1975年出现短暂下降，但根据2012年的中国恶性肿瘤发病和死亡分析报告，因宫颈癌而导致的病死率年均增速仍达到8.1%[8]。此外，在全球范围内，2018年新发宫颈癌病患约56.9万例，其中死亡病例数占到31.1万例左右，而且病死患者中的84%都属于经济欠发达地区。预计到2030年，这一比例会增加至98%。根据中国国家癌症中心公布的数据，近几年宫颈癌发病率年均增速已达8.7%[9]。另外，据最新研究报道[10]，虽然宫颈癌病死率在我国东部地区仍在继续上升，尤其中西部地区病死率仍较高，但与以往相比比已有明显下降。1.3HPV致病机制HPV基因按照其不同基因片段调控功能的不同可分为上游调控区、早期区、晚期区。上游调控区包含一个顺式调控单元和HPV病毒的复制起点，负责调控病毒基因复制和转录的起始；早期区能够编码早期蛋白E1、E2、E4、E5、E6和E7，通过影响DNA复制、RNA转录和蛋白翻译的过程，参与HPV病毒的整个生命周期、［11］；晚期区负责编码晚期蛋白L1和L2，即病毒的外壳蛋白，而病毒的外壳蛋白是细胞表面吸附、病毒包装及侵入细胞质的关键蛋白。对于HPV病毒而言，蛋白E1、E2、E4、E5、E6和E7是其增殖繁衍的关键功能蛋白，我们可以通过了解这些蛋白的的具体功能来了解HPV基因的致病机制。E2蛋白在HPV基因转录过程不同时期中发挥相应调节作用。在病毒侵染宿主后至与宿主基因组开始整合的期间，E2蛋白能够特异性识别并结合靶位点E2BSs，然后导致特异性蛋白SP1和TATA结合蛋白TBP因此发生移位，进而抑制病毒转录的过程。相应的研究报道显示，当将E2基因导入宫颈癌细胞SiHa中后，癌细胞数量因此明显下降，说明癌细胞的发展受到抑制［12］；另外有研究表明，在与宿主基因组整合后的癌细胞中，E2基因处于甲基化状态，说明当E2基因甲基化而不能发挥作用时，癌细胞才能正常增殖，证实了E2蛋白对HPV转录的阻滞作用［13］。E5蛋白在HPV持续感染的过程中起到维持以及介导免疫逃逸的作用。在病毒与宿主细胞基因组整合后，细胞内受体酪氨酸激酶（Met）的表达被E5蛋白上调，从而维持病毒复制和转录过程延续其生命周期［14］。当外源DNA入侵女性自身免疫系统时，宫颈上皮细胞会发生应激反应，在基底层发生分裂并迅速凋亡、脱落，从而尽量减小病毒对人体带来的危害［15］。而E5蛋白的主要作用是通过上调表达环氧合酶-2，发挥促凋亡相关基因Bax的降解作用，与此同时激活表皮生长因子受体EGFR，延缓基底细胞分裂分化，使病毒能够持续侵染宫颈上皮细胞［16］。在介导免疫逃逸方面，高危型HPV侵染宿主细胞初期，宿主的自身免疫作用可以产生大量CD8＋T细胞，CD8＋T细胞是具有特定识别肿瘤细胞功能的T细胞，它能够识别肿瘤细胞表面主要的组织相容性复合体类分子MHC，导致肿瘤细胞死亡，而E5蛋白具有能与MHC类分子的重链发生互作的疏水区，E5蛋白的疏水区因此能够抑制MHC的抗原提呈，使宿主得免疫应答功能受损［17］。E5蛋白介导宿主免疫应答，使宿主的抗病毒能力下降。E6、E7蛋白是关键的致癌基因。E6、E7蛋白在被感染细胞存在的位置影响到HPV的致病力，当其存在于被感染细胞的胞质时，无法诱导恶性转化［18］，而当其存在于宿主细胞的细胞核时，则能够维持HPV阳性癌细胞恶性表型。研究表明，在E6蛋白的羧基端存在一个PDZ结合模序（PBM），E6蛋白可以借助PBM与PDZ蛋白互作，促使病毒DNA进入细胞内，继而引发感染，进一步地HPVE6蛋白能够结合诱导p53基因降解，并且能以肿瘤抑制基因pRb作为结合靶点，阻止肿瘤细胞凋亡［19］。此外，HPV的E6、E7蛋白促进宫颈癌发生的分子机制具体如下［20］：信号通路方面分子机制。根据前人的研究报道，E6蛋白可通过影响calcineurin-NFAT2信号通路表达，从而促进癌细胞增殖。E6蛋白可以介导T细胞因子4（TCF-4）的转录因子与β-catenin结合，并诱导TCF-4产生稳定化状态转变，Wnt/β-catenin信号通路上调，进而促进癌细胞持续性增殖。此外，TOLL样受体（TLR）是人类非特异性免疫识别受体，在人类癌细胞中广泛表达，E6蛋白能与TLR－2、3、7、8、9等相互作用，破坏免疫反应，促进癌细胞对宿主的侵染。（2）长链非编码RNA（lncRNA）相关分子机制。在宫颈癌相关研究过程中，研究人员发现E6、E7蛋白能通过下调lnc-CCDST表达来减弱其对于癌细胞的抑制作用，lnc-CCDST是一种能抑制宫颈癌细胞运动和癌细胞生成的新的lncRNA。此外，E6、E7蛋白还可以通过转录因子c-Myc介导lncRNASNGH12上调表达，进而使E-钙黏着蛋白转录抑制因子Slug的表达量增加，Slug的表达量增加会使组织内细胞黏附强度降低，这使得癌细胞更易扩散，其迁移、侵袭和上皮间质转化（EMT）能力增强。（3）miRNA相关分子机制。E6蛋白可以通过上调miRNA-20a间接使细胞程序性死亡蛋白6的表达上调，促进宫颈癌细胞增殖；而E7蛋白与pRb结合后可使miR-182表达上调，促使宿主细胞发生癌变；此外，E6、E7蛋白还能够使miR-146b-3p的上调表达，进而抑制15羟基－前列腺素脱氢酶的作用，15-羟基前列腺素脱氢酶（15-PGDH）是降解前列腺素（PG）的关键酶，其表达减少可促进肿瘤侵袭和转移，最终导致癌变发生［20］。（4）其他途径。HPVE6、E7基因能够调节白细胞介素-6的表达，宫颈癌细胞中白细胞介素-6的表达水平上调会引发宫颈炎症，宫颈炎症通常伴随着高度增殖的微环境，这使得宫颈细胞癌变的几率大大增加。此外，HPVE6、E7蛋白能够使pirin基因上调表达，进而促进EMT，促使宫颈癌变发生。2HPV基因检测技术及其研究进展HPV基因的实验室检测方法有很多种，主要可以分为三种类型：细胞学检测方法、DNA检测方法、RNA检测方法。2.1细胞学检测方法细胞学检测方法即传统检测方法，如宫颈涂片和液基细胞学等，也可以通过对子宫脱落细胞进行病毒L1蛋白的单抗检测来判断患者是否感染HPV，在临床上一般适用于进行普查，这一类检测方法的特点是：操作简便易行，特异度较高，但灵敏度不够高，成本低廉，整体检测效率较低，不能实现HPV分型。但是，目前随着人工智能的不断发展，AI辅助细胞学检测已经获得了较大进展，通过研究发现，在相同条件下，AI辅助阅读的敏感性(相对敏感性1.01，95%CI：0.97-1.05)与细胞学专家类似，并且AI辅助阅读的特异性甚至高于细胞学专家(相对特异性1.26，95%CI：1.20-1.32)[21]。在未来，AI辅助检测能够很大程度上规避细胞学检测的不足。2.2基于DNA检测方法HPVDNA检测的基本原理是依据碱基互补配对的原则，针对HPV基因组上存在的特定序列进行相对应的引物和/或探针设计，利用探针与病毒基因序列的特异性结合，采用PCR扩增的手段获得预期片段，再进行定性或定量检测。与传统的检测方法相比，DNA检测的灵敏度更高并且特异性更强，能够实现HPV分型，但也存在一个问题，就是即使在宿主宫颈细胞中检出HPV的DNA片段也只能说明病毒确实存在，并不代表一定发生了宫颈病变。到目前为止，HPVDNA检测的方法已经有很多，各有优缺点［22］。（1）芯片杂交技术是指首先对HPV靶基因的基因序列进行酶标，酶标后再与固相支持物上的探针分子进行杂交显色，这样可以同时一次性实现多种HPV的亚型分析，这个方法的优点是通量高、速度快的特点，缺点是操作复杂、且易发生交叉污染。另外，AdvanSure和双巢式PCR是在PCR方法的基础上进行改良，基础操作均类似，不同的是在引物设计时进行多重引物设计，通进而实现多重HPV亚型的检测[23,24]，该方法的优点是灵敏度较高，缺点是易发生污染。（2）数字PCR技术，即“第三代PCR”，它是通过数字PCR仪在无标准曲线的情况下，对分子靶标进行绝对定量检测的技术，虽然目前在临床上目前还不能全面推广，但可以针对特殊紧急的病患进行针对使用，它的特点是检测灵敏度高、准确定量，但成本高、通量低、且操作复杂。（3）目前瑞金医院检验科HPV核酸检测及基因分型试剂盒采用的是PCR毛细电泳片段分析法，原理是利用多重PCR和毛细电泳技术，针对宫颈细胞的E6、E7、E1基因进行引物设计，将不同HPV型别分类的基因进行PCR扩增及毛细电泳分离，由于不同基因扩增片段的长度不同，毛细电泳后条带的位置也因此不同，这样就能够在一次检测中对多种HPV型别进行同步分型[25]。瑞金HPV核酸检测及基因分型试剂盒可以用于体外定性检测女性宫颈脱落细胞样本中的25种HPV基因型别鉴定。这25种HPV基因型别包括：6、11、16、18、26、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、81、82、83等，在临床的辅助诊断上可以使用，但是不能用于宫颈癌筛查相关预期用途。它的优点是操作简单规范，可以一次对多种HPV基因型别进行鉴定，定性检测结果重复性好，可在临床上广泛使用，缺点是对样品采集、转运、储存、和处理过程有相应要求，如果不能很好符合要求，会影响检测结果，试剂盒检测结果仅供临床参考，还要综合考虑患者的临床症状或体征以及实验室检查的其他情况，最终作出判定。总得来说，基于DNA的检测方法灵敏度特异性和效率成本很难兼得，在实际的临床应用中应当根据不同的情况作出相应的选择，以达到检测更加高效、准确、实用。2.3基于RNA检测方法HPVDNA检测的基本原理与HPVDNA检测类似，但是通过HPV的致病机制我们发现，病毒DNA是通过整合到宿主基因组中，进行转录翻译后发挥作用的，那么由此可见，HPVmRNA检测相比HPVDNA检测，前者或许在临床上能更直接和准确地发现HPV感染人群。研究人员GE等[26]对细胞学表现正常而HPVmRNA检测阳性的女性行组织学筛查，结果发现了17.3%(95%CI：16.2-18.4)CIN3+和16.4%(95%CI：15.3-17.5)CIN2+的患者，另外再分别单独进行HPVmRNA检测和细胞学检查，结果单独进行HPVmRNA检测的敏感性更高，而单独细胞学检查的特异性仍较高。此外，GRANADOS等对年龄段在35岁以下且HPVmRNA检测呈阳性的女性进行筛查发现，CIN2+病变的发生率最高，并且当他们是HPV16/18/45阳性时，所有的活检结果显示为CIN2+病变的患者均为HPVmRNA阳性。对低度鳞状上皮内和不典型鳞状上皮细胞病变来说，通过HPVmRNA检测的结果比HPVDNA检测的特异性更高，结果相对更加可靠[27]。HPVDNA检测通常情况下比较容易做到灵敏度较高，但整体上看特异性不高。而根据研究结果显示，在统计学分析上HPVE6/E7mRNA检测比HPVDNA检测阳性预测值更高、特异性更强，并且不论是HPVmRNA检测还是HPVDNA检测，其阳性率均随着病变程度的增加而增加，另外通过HPVmRNA检测的活检结果表明其≥HSIL的特异性和阳性预测价值明显高于DNA检测。因此，我们可以看到，HPVmRNA检测与HPVDNA检测相比有较为独特的优势，具有更好的临床应用价值，HPVmRNA检测可用作临床风险分层[28]。另外，根据国外学者研究显示[29]，HPVDNA检测与HPVmRNA检测的纵向敏感性相似，检测诊断结果也基本一致，李晓林等也[30]发现，针对E6和E7基因的mRNA检测诊断结果与HC-2DNA检测HPV相同，敏感度和特异性表现也十分类似，这说明针对E6和E7基因的mRNA检测用于宫颈筛查相对比较安全。但E6和E7mRNA检测能否进行大规模临床筛查，仍需临床研究中更加充分的数据支持。3HPV预防与宫颈癌治疗宫颈癌的早期筛查和HPV疫苗的研发应用是HPV预防的主要措施，能够在很大程度上降低宫颈癌病死率。而疫苗接种可能是消除发展中国家宫颈癌的一个长期有效的措施[31]。HPV疫苗主要分为治疗性疫苗和预防性疫苗，截至目前，疫苗研究主要针对的是高危型HPV，治疗性疫苗的工作原理是，通过激活宿主细胞的自身免疫反应产生T细胞或溶菌酶来清除癌变细胞，治疗性疫苗所针对的靶抗原一般是E6、E7关键致病蛋白，通过重新激发宿主特异性T细胞介导的免疫反应，以清除癌变细胞［32］。预防性疫苗是诱导体液的免疫应答产生一定数量的中和抗体，通过中和抗体在很长的一段时间内来预防HPV感染。目前我国正大力推广适龄人群预防性疫苗的接种。临床试验结果显示，目前市场上的九价疫苗能预防多种类型HPV引起的高级别宫颈、外阴、阴道病变，且疫苗的预防效果持续时间较长，最长可达6年以上。虽然疫苗的预防和治疗效果显著，但其价格昂贵、且必须低温运输，目前大多数的发展中国家还不具备相应条件，无法进行推广。值得高兴的是，由于新冠疫情的爆发，国内基层检验科的分子生物学实验室发展迅速，这也为HPV亚型的检测提供了强有力的支持。同时由于现在基因组数据十分庞大便捷，新兴的生物信息学与计算机应用、系统生物学联合，能够更加快速推进疫苗的研发进程，不同于传统的DNA病毒疫苗的研发方向，减毒活疫苗、灭活病毒或类病毒重组疫苗研发正在持续推进当中［33］。目前临床上使用的HPV预防性疫苗主要包括二价疫苗、四价疫苗和九价疫苗，其中二价疫苗主要针对HPV16和HPV18型病毒感染；四价疫苗主要针对6、11、16、18型HPV感染；九价疫苗主要针对HPV6、11、16、18、31、33、45、52、58九种亚型，二价苗的免疫效价最高，青少年由于性器官发育尚未成熟，免疫功能较低，但性心理却出现早熟趋势，所以是重点接种人群。除了疫苗之外，还有一些药物也具有预防感染作用，比如重组人干扰素α-2a、保妇康栓。重组人干扰素α-2a是广谱抗病毒药物，能够与癌细胞表面的受体结合，直接抑制病毒蛋白的合成，促进人体自身免疫反应，清除被病毒感染的细胞。保妇康栓是一类中药制剂，具有抗单纯游离病毒感染的作用，而且能够抑制宿主细胞染色体上的病毒基因片段整合，促进人体自身免疫反应。目前开发更有效、针对性更强的疫苗或是药物是研究人员的主要方向，这需要深入理解HPV基因组及其致病蛋白，为临床治疗宫颈癌提供新思路，例如已经有研究发现，miR－221在SOCS1／TypeIIFN信号通路中起关键作用，它可以抑制HPVDNA的复性；lncRNASNGH12、TMPOP2、lnc-CCDST的表达水平对HPVE6、E7蛋白的活性能够产生重要影响［34］，这些研究成果都有可能成为潜在的治疗靶点，为新的靶向药物研发提供理论基础。最后，要预防HPV，需要养成良好的生活习惯。长期吸烟、多胎生育、衣原体感染和长期服用激素类避孕药会增加宫颈癌患病风险[35]。因此总得来说，预防宫颈癌主要是从三方面入手，一是需要加强生活习惯方面的认知，二是通过宫颈癌早期筛查，三是通过疫苗和药物的介入。4前景展望高危HPV的高致病性严重影响了全球女性的健康生活，已经带来了严重后果，相应年龄段人群养成良好的生活习惯，提前预防、注射疫苗、早发现早治疗是预防宫颈癌发病的有效措施。通过回顾近些年来科研人员在HPV的检测、预防和治疗方面的研究进展，我们可以看到尽管研究人员对于HPV致病机制的研究已经有了诸多的突破，对于HPV的检测和预防也有许多有效手段，但事实上这一疾病仍然由于许多原因为全球许多女性带来了困扰，我们要做的是立足当下，尽可能多的去解决各方面的问题，让这一疾病尽早淡出人们的视野。参考文献：FITZMAURICEC，DICKERD，PAINA，etal．Theglobalburdenofcancer2013［Z］．2015:505－527．WalboomersJM,JacobsMV,ManosMM,etal.Humanpapillomavirusisanecessarycauseofinvasivecervicalcancerworldwide[J].JPathol,1999,189(1):12-19.EibenGL,daSilvaDM,FauschSC,etal.Cervicalcancervaccines:recentadvancesinHPVresearch[J].ViralImmunol,2003,16(2):111-121.MunozN,BoschFX,deSanjoseS,etal.Epidemiologicclassificationofhumanpapillomavirustypesassociatedwithcervicalcancer[J].NEnglJMed,2003,348(6):518-527.SERRNAOB，BROTONSM，BOSCHFX，etal．Epide-miologyandburdenofHPV-relateddisease［J］．BestPractResClinobstetGynaecol,2018,47(1):14-26．黄晓梅．宫颈癌的早期症状及影响因素研究［J］．中国继续医学教育，2018，10(7)：79-80．DEMARTELC,PLUMMERM,VIGNATJ,etal．WorldwideburdenofcancerattributabletoHPVbysite,countryandHPVtype［J］．IntJCancer，2017，141（4）：664-670．]陈万青,郑荣寿,张思维,等.2012年中国恶性肿瘤发病和死亡分析[J].中国肿瘤,2016,25(1):1-8.包鹤龄,刘韫宁,王黎君,等.中国2006-2012年子宫颈癌死亡情况与变化趋势分析[J].中华流行病学杂志,2017,38(1):58-64.陈一凡，戚欣，李静，等．宫颈癌的发病机制、药物治疗及新治疗策略［J］．食品与药品，2019，21（3）：242－246．李雪琨，程波，刘珊，等．HPV16E2基因促进宫颈癌SiHa细胞的凋亡［Ｊ］．基因组学与应用生物学，2019，38（10）：4832－4836．ZhangXA,ZhiYF,LIY,etal．StudyontherelationshipbetweenmethylationstatusofHPV16E2bindingsitesandcervicallesions［J］．ClinChimacta，2019，493（1）：98－103．SCOTTLM,COLEMANTD,KEELLYCK,etal．Humanpapillmavirustype16E5-mediatedupregulationofMetinhumankeratinocytes［J］．Virology,2018,519（1）：1－11．ILAHINE,BHATTIA．ImpactofHPVE5onvirallifecycleviaEGFRsignaling［J］．MicrobPathog,2020,139（1）：103923．HEMMATN,BAGHIBH．HumanpapillomavirusE5protei，theundercoverculpritoftumorigenesis［J］．InfectAgentCancer,2018,13（1）：31．简洁，杨嘉洁，李婉宜，等．人乳头瘤病毒16型E5蛋白在宫颈癌中表达及其作用的研究进展［J］．现代预防医学，2017，44（5）：950－953．STEINBACNA,RIEMERAB．Immuneevasionmechanismsofhumanpapillomavirus:anupdate［J］．IntJCancer,2018,142（2）：224－229SUNLN,ZHAOL,LID,etal．LowriskHPV-6E6inducesapoptosisinbonemarrow－derivendriticcells［J］．OncolLett2018,15（1）：1157－1162．杨俊东,邢志芳,曹国君.高危型人乳头瘤病毒的研究进展[J].检验医学与临床,2020,17(23):3406-3409.郑楚丽,宋硕,谭晓瑜,符爱珍.宫颈癌筛查方法及其进展[J].海南医学,2021,32(05):662-665.邹普润,周卫华,夏柳,黄丽颖,舒丹,周梦煌,林彤.宫颈癌早期筛查方法的研究进展[J].湖北民族大学学报(医学版),2020,37(04):48-51.KOK,YUS,KWONMJ,etal．ComparisonofadvansureHPVgenoblotandhybridcapture2assaysfordetectionofHPVinfection[J]．JClinLabAnal，2018，32（1）:e22161．TAWEL,GROVERS,NARASIMHAMURTHYM,etal．Moleculardetectionofhumanpapillomavirus(HPV)inhighlyfragmenteddnafromcervicalcancerbiopsiesusingdouble-nestedPCR[J]．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