实验动物与动物实验方法教案-动物实验的常用实验技术动物血液的采集方法

PAGEPAGE14第三篇动物实验的常用实验技术第一章动物实验的基本操作第一节实验动物的编号大鼠和小鼠的编号一般都用不同颜料涂染皮毛的方法来标记，常用的涂染化学品如下①涂染黄色用3～5%苦味酸溶液;②涂红色用0.5%品红溶液等。前者最常用。在动物固定的不同部位涂上苦味酸斑点表示不同号码。一般习惯在左前腿上为1，腰部为2，在左后腿上为3，在头部为4，在正中为5，在尾基部位6，在右前腿为7，在右侧要不为8，在右后退上为9，不涂染鼠为10。如果试验时动物编号超过10，可在动物同一部位上再涂染另一种涂染剂。标记方法如图。第二节动物的捉持和固定一、小白鼠的捉持：捉拿时可先用右手抓住并提起鼠尾，置于实验台或鼠笼上，并稍向后拉；用左手的拇指和食指抓住小鼠两耳后颈背部的皮肤，将鼠置于左手心中，拉直后肢，以无名指及小指按住鼠尾或小鼠的左后肢即可。二、大白鼠的持：大白鼠的捉拿时，可戴上手套。实验者可用右手捉住鼠尾，放在实验台或鼠笼上，并稍向后拉；左手掌面向鼠背，食指和中指压住鼠的头顶，拇指和无名指分别从鼠的两腋下插入，将鼠的两前肢卡住；或拽紧鼠后颈及后背皮肤即可。三、家兔的捉持：用一手抓住家兔颈背部皮肤，将兔提起，另一手托其臀部，使兔呈坐位姿势。第三节常用动物的给药方法一、小鼠、大鼠常用的给药方法1、灌胃（ig）：左手将动物固定后，右手持装有灌胃针头的注射器，自口角进针，沿上腭向鼠口腔的后下方插入食管。一般的给药量小鼠为0.1～0.3ml／10g，大鼠为1～2.0ml／100g。2、皮下注射（sc）:常在背部皮下注射。一手固定动物，另一只手注射给药。一般给药量小鼠为0.1～0.20ml／10g，大鼠为1ml／100g。3、腹腔注射（ip）:左手固定动物，右手持注射器，从下腹部外侧，呈45度角刺入腹腔，进针约3～5mm，一般给药量小鼠为0.1～0.3ml／10g，大鼠1～2.0ml／100g。4、肌内注射（im）：多注射后肢股部肌肉。如一人单独操作，以左手拇指和食指抓住小鼠头部皮肤，小指、无名指和掌部夹住鼠尾及一侧后肢，右手持注射器刺入后肢肌肉给药。一般小鼠每侧不超过0.1ml。5、尾静脉注射（iv）：将动物固定，鼠尾巴露在外面，用70%～75%的酒精棉球擦尾部，或将鼠尾浸入45～50℃温水中。待尾部左右静脉扩张后，左手拉着尾，右手进针。小鼠一般的给药量为0.1～0.2ml／10g。二、家兔常用的给药方法灌胃：（略）皮下、肌内及腹腔注射：给药方法基本上同小白鼠，为针头稍大，给药量可稍多（皮下与肌内0.5～1.0ml／kg，腹腔1.0～5.0ml／kg）。静脉注射：将家兔置固定箱内，拔去耳克外缘的毛，选择一条比较明显的耳缘静脉，用酒精棉球涂擦皮肤，使血管暴露。用左手拇指和中指捏住兔的耳尖，以食指垫在兔耳拟进针部位的下面，右手持注射器，从近耳尖处将针头刺入血管。推注时如有阻力，局部出现肿胀，表明针头部在血管内，应立即拔针重新穿刺。一般药液为0.2～2.0ml／kg，等渗药液可达10ml／kg。第四节动物的性别鉴定一般情况下，哺乳类动物性别依据动物的肛门与外生殖器(阴茎或阴道)之间的距离加以区分。雄性要比雌性的距离更长。大、小鼠雌雄动物肛门与外生殖器间距离第五节动物处死方法1、颈椎脱臼法：本法常用于小鼠的处死。左手拇指、食指用力向下按住鼠头，同时右手抓住鼠尾用力向后上方拉，将脊髓与脑髓拉断，鼠即死亡。2、断头法：用剪刀将鼠头剪断，由于脑髓与脊髓断离且大量出血，动物很快死亡。麻醉后的家兔也可采用此法。3、击打法：提起鼠尾，用力棒击头部，或用小木棰打击头部，鼠痉挛立即死亡。家兔也可采用此法。家兔等大动物常采用空气拴塞法、放血法、窒息法处死。也可用过量麻醉药注入法等方法处死动物。第二章动物血液的采集方法第一节大鼠、小鼠的血液采集方法一、眶静脉丛（窦）采血小鼠为眶静脉窦，大鼠为眶静脉丛。可先将动物侧眼向上固定体位，左手拇指及食指轻轻压迫动物的颈部两侧，使眶静脉丛（窦）充血。右手持注射器或硬质毛细玻璃管，用采血管由眼内角在眼睑和眼球之间向喉头方向刺入。若为针头，其斜面先向眼球，刺入后再转180°角使斜面对着眼眶后界。刺入深度：小鼠约2mm～3mm，大鼠约4mm～5mm。然后将采血管保持水平位，稍加旋转并后退吸引。二、眶动脉和眶静脉取血常用摘眼球法从眶动脉和眶静脉取血，多用于小鼠。操作时，用左手抓住动物颈部皮肤，将动物轻压在实验台上，取稍侧卧位，左手拇食指尽量将动物眼周围皮肤往眼后压，使其眼球突出充血后，用弯头眼科镊迅速夹去眼球，并将鼠倒置，头向下，眼眶内很快流出血液。一般取血量约为小鼠体重4％～5％。三、尾静脉采血首先将动物尾巴置于45℃～50℃热水中，泡数分钟，也可用酒精或二甲苯反复擦拭，使尾部血管扩张，擦干，剪去尾尖（小鼠约1～2mm，大鼠5～l0mm），血自尾尖流出，让血液滴入盛器或直接用吸管吸取。也可用试管等接住，自尾根部向尾尖按摩，血液会自尾尖流入试管。四、大血管采血大、小鼠可从颈动（静）脉、股动（静）脉等大血管采血。在这些部位取血均需麻醉后固定动物，然后作动（静）脉分离手术，使其暴露清楚后，用注射器沿大血管平行方向刺入，抽取所需血量。小鼠、大鼠还可以从腹主动脉采血。首先进行深麻醉，仰卧位固定，打开腹腔，将肠管推向一侧，然后用手指轻轻分开脊柱前的脂肪，暴露出腹主动脉。针头在向心端方向平行刺入，立即采血。大鼠和小鼠还可采用断头取血、心脏取血。第二节家兔、豚鼠的血液采集方法一、耳中央动脉采血兔耳中央有一条较粗、颜色较鲜红的中央动脉。采血时，用左手固定兔耳，右手持注射器，在中央动脉末端，沿着动脉平行的方向刺入动脉，刺入方向应朝向近心端。不要在近耳根部进针，因其耳根部组织较厚，血管游离，位置较深，不清晰，易刺透血管造成皮下出血。一般用6号针头采血。取血完毕后注意止血。此法一次可抽取10ml～15ml。二、耳缘静脉采血耳缘静脉采血多用于家兔等动物的中量采血，可反复采取。采血姿势与耳缘静脉注射给药相同。操作时，将兔固定于兔盒内或由助手固定，选静脉较粗、清晰的耳朵，拔去采血部位的被毛，消毒。为使血管扩张，可用手指轻弹或用二甲苯涂擦血管局部。用6号针头沿耳缘静脉远心端刺入血管。也可以用刀片在血管上切一小口，让血液自然流出即可。取血后，用棉球压迫止血。此法一次可采血5ml～10ml。三、心脏采血将兔仰卧固定，用左手触摸左侧第3～4肋间，选择心跳最明显处穿刺。一般由胸骨左缘外3mm处将注射针头插入第3～4肋间隙。当针头正确刺入心脏时，由于心搏的力量，血会自然进入注射器。采血中回血不好或动物躁动时应拔出注射器，重新确认后再次穿刺采血。经6天～7天后，可以重复进行心脏采血。豚鼠的心脏采血亦较常用。第三章动物实验手术基本操作技术切开根据实验要求确定手术切口的部位及大小。切开时先绷紧皮肤，将刀刃与皮肤垂直，用力要得当，一般将切开皮肤全层，切口整齐不偏斜。切开皮及皮下组织时，一定要求按解剖层次逐层切开，注意止血，避免损伤深层的重要组织器官。组织分离1、锐性分离：用刀、剪等锐性器械作直接切割的方法，该法用于皮肤、粘膜、各种组织的精细解剖和紧密粘连的分离。使用刀柄、止血钳、剥离器或手指等分离肌肉、筋膜间隙的疏松；结缔组织的方法。四、止血止血是手术操作中的重要环节。手术过程中止血完美与否，不仅直接影响手术部位的显露和手术操作，而且关系到手术后动物的安全、切口愈合的好坏以及是否造成并发症等。术中止血必须准确、迅速、可靠。术中止血方法有：1、压迫止血：手术中出血一般可先用无菌纱布或拧干的温热盐水纱布按压片刻，切勿用纱布擦拭，以减少组织损伤。2、钳夹止血：用止血钳与血流方向垂直夹住血管断端，停留一段时间后取下止血钳。3、结扎止血：出血点用纱布压迫蘸吸后，用止血钳夹住血管断端，再用丝线结扎止血。结扎时，先竖起止血钳，将结扎线绕过钳夹点之下。第四章动物尸检的方法动物尸检是动物实验中的一个重要方法，通过对实验动物进行病理解剖观察，可对实验结果进行判定，也可分析死亡原因等。具体尸检方法时，应首先复查动物编号、性别和实验分组，记录死亡或活杀时间、解剖时间。然后检查动物外形：年龄、胖瘦、毛色、皮肤出血情况，生殖器官病变情况等。在完成尸体外部检查之后，为了全面而系统地检查尸体内外所呈现的病理变化，需要采出脏器检查，而必须要按照一定的顺序进行。虽然各种动物大小不一，解剖结构不同，某些疾病的特殊要求，以及剖检者的习惯不同，剖检顺序有一定的灵活性，但常规脏器采出与检查一般遵循下列顺序：剥皮和皮下检查一腹腔的剖开和腹腔脏器的视查→胸腔的剖开和胸腔脏器的视查→腹腔脏器的采出→胸腔脏器的采出→口腔和颈部器官的采出→骨盆腔脏器的采出和检查→颅腔剖开和脑的采出与检查→鼻腔的剖开和检查→脊椎管的剖开和脊髓的采出与检查→肌肉和关节的检查→骨和骨髓的检查。第五章动物各种体液的采集方法一、尿液的采集方法1．代谢笼采集尿液将动物放在特制的笼内饲养，动物排便时，可通过笼子底部的大小便分离漏斗，将尿液与粪便分开，达到采集尿液的目的。2．输尿管插管采集尿液在动物输尿管内插一根塑料套管收集尿液。适用于兔、猫、犬等。3．膀胱手术插管采集尿液一般用于犬等较大动物。4．穿刺膀胱采集尿液二、胆汁、胰液、肠液的收集方法(—)胆汁的收集方法一般采取手术收集。以大鼠为例，手术前禁食16小时～18小时，饮2.5％葡萄糖盐水。将动物腹腔麻醉后，仰卧于实验台上，从背至腹中线去毛、消毒。自剑突下及腹中线做3cm～5cm的切口。肌肉钝性分离，切开腹膜，暴露腹腔，将肝脏向上翻起。在门静脉一侧，找出肝、胆总管。分离出胆总管，在胆总管靠近十二指肠的膨大后端剪开小切口，用剪成斜口的聚乙烯管尖端由此插入，一直向上插入至肝总管后，结扎固定，可收取胆汁。注意：若插管前端插在胆总管处，收集到的将是胆汁和胰液混合液。为准确起见，可在肝总管处剪切口插入。(二)胰液的收集方法大鼠的胰液收集麻醉大鼠，在固定板上仰卧固定。上腹部剑状突部位下作3cm左右腹正中切口，找出十二指肠和胃的交界处，用线在交界处穿线备用。然后找到胆总管。大鼠胰管很多，包括前大胰腺管、后大胰腺管，以及许多小胰腺管。大鼠的所有胰腺管均不直接开口于十二指肠而都开口于胆总管