75%乙醇对黑曲霉菌的杀灭效果研究

摘

要：目的：了解一定时间内75%乙醇对黑曲霉菌的杀灭效果。方法：采用75%乙醇对黑曲霉菌菌悬液进行定量杀菌试验，分别用2mL

75%乙醇对2mL菌悬液进行作用、4mL

75%乙醇对4mL菌悬液进行作用、6mL

75%乙醇对6mL菌悬液进行作用、8mL

75%乙醇对8mL菌悬液进行作用、10mL

75%乙醇对10mL菌悬液进行作用，作用时间为40min。结果：部分平皿有菌落生长，生长菌落的时间点不同，菌落数均小于菌悬液对照组的2%，通过3组试验结果计算，被75%乙醇杀灭的菌落总平均比值为99.781%。结论：75%乙醇对黑曲霉菌有较强的杀灭效果，但在一定时间范围内，黑曲霉菌没有完全被75%乙醇杀灭。关键词：75%乙醇；菌悬液；黑曲霉菌；杀灭效果

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引言75%乙醇是较为常用的消毒液，试验室通常用75%乙醇消毒桌面、台面以及洁净区房间，甚至用75%乙醇浸泡带菌物品。按照2017年版消毒技术规范（2.1.1.9真菌杀灭试验）规定，消毒剂对黑曲霉菌的杀灭对数值≥5.00。黑曲霉菌（Aspergillusniger）是一种常见真菌，早在2002年版消毒技术规范关于试验指标菌的规定中，黑曲霉菌被定为致病性真菌的代表。鉴于黑曲霉菌培养的特殊性，一些研究者对其进行了检测，并做了有关消毒剂对黑曲霉菌杀灭效果的评价，但对一定时间内消毒剂对黑曲霉菌的杀灭效果评价报道较少。为了解75%乙醇消毒液在一定时间内对黑曲霉菌的消毒效果，本文对黑曲霉菌菌悬液进行了杀菌试验，以研究75%乙醇对黑曲霉菌的杀灭效果。

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仪器与材料1.1

仪器电热恒温培养箱；生物安全柜。1.2

材料沙氏葡萄糖琼脂培养基；黑曲霉菌[CMCC（F）98003]；0.9%无菌氯化钠溶液；吐温-80；75%乙醇。

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试验方法2.1

黑曲霉菌孢子悬液的制备首先，取黑曲霉菌[CMCC（F）98003]冻干菌种管，用麦芽浸膏肉汤培养基进行增菌培养，再经过沙氏葡萄糖琼脂培养基平板划线进行分离培养，选取单个典型菌落接种于沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，在23℃条件下培养7天，得到新鲜培养物。然后，取5mL

0.9%无菌氯化钠溶液洗下斜面上的孢子，将孢子洗脱。最后，采用无菌注射器吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1mL含黑曲霉菌孢子数100～200CFU的孢子悬液备用。2.2

中和剂的制备取含20g/L吐温-80的胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）作为中和剂，能起到有效中和75%乙醇对试验菌的残留作用。2.3

75%乙醇对黑曲霉菌的杀菌试验将75%乙醇分装成0mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL的消毒液（阳性对照用0.9%无菌氯化钠溶液），置于室温下备用；取分别2mL、4mL、6mL、8mL、10mL的黑曲霉菌孢子悬液（黑曲霉菌孢子数100～200CFU）于5支无菌试管中。然后，用不同体积的75%乙醇分别对5个不同体积的孢子悬液进行作用至预定时间，取0.5mL菌药混合液加入至4.5mL的中和剂（含20g/L吐温-80的TSB）管内。中和作用10min，取样品液接种进行活菌计数培养，计算杀灭对数值。该试验重复3次。

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试验结果上述试验重复做3次，试验结果及分析分别如表1、表2、表3所示。在表1中，0

mL的75%乙醇为菌悬液对照组。黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合后，每组数据显示黑曲霉菌均已被大幅度杀灭。2mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合30min后有1个黑曲霉菌菌落生长；4

mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合35

min后有1个黑曲霉菌菌落生长；6mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合30min后有2个黑曲霉菌菌落生长；8mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合20min后有1个黑曲霉菌菌落生长，8mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合30min后有1个黑曲霉菌菌落生长；10mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合30min后有1个黑曲霉菌菌落生长，10mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合35min后有1个黑曲霉菌菌落生长。上述5组试验生长的菌落数均小于菌悬液对照组的2%，生长黑曲霉菌的时间点不是随着时间的变化而变化，大部分的黑曲霉菌已经被杀灭，残留极少的黑曲霉菌在混合液中分布不均匀。因此，在每个时间点都可能会生长黑曲霉菌。另外，35min内黑曲霉菌没有完全被杀灭，未被消毒液杀灭的菌落平均比值为0.183%。在表2中，0

mL的75%乙醇为菌悬液对照组。黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合后，每组数据显示黑曲霉菌均已被大幅度杀灭。4mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合35min后有1个黑曲霉菌菌落生长；6mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合15min后有1个黑曲霉菌菌落生长，6mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合20min后有2个黑曲霉菌菌落生长，6mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合30

min后有2个黑曲霉菌菌落生长；8mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合30min后有1个黑曲霉菌菌落生长；10mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合20min后有1个黑曲霉菌菌落生长，10mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合25min后有1个黑曲霉菌菌落生长，10mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合40

min后有1个黑曲霉菌菌落生长。上述5组试验生长的菌落数均小于菌悬液对照组的2%，生长黑曲霉菌的时间点不是随着时间的变化而变化，大部分黑曲霉菌已经被杀灭，残留极少的黑曲霉菌在混合液中分布不均。因此，在每个时间点都可能生长黑曲霉菌。另外，40min内黑曲霉菌没有完全被杀灭，未被消毒液杀灭的菌落平均比值为0.283%。在表3中，0

mL的75%乙醇为菌悬液对照组。黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合后，每组数据显示黑曲霉菌均已被大幅度杀灭。2mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合30

min后有1个黑曲霉菌菌落生长；4mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合20

min后有1个黑曲霉菌菌落生长，4

mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合25min后1个有黑曲霉菌菌落生长，4mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合35min后有1个黑曲霉菌菌落生长；6mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合25min后有2个黑曲霉菌菌落生长；8mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合20min后有1个黑曲霉菌菌落生长。上述5组试验生长菌落数均小于菌悬液对照组的2%，生长黑曲霉菌的时间点不是随着时间的变化而变化，大部分黑曲霉菌已经被杀灭，残留极少的黑曲霉菌在混合液中分布不均。因此，在每个时间点都可能生长黑曲霉菌。另外，35min内黑曲霉菌没有完全被杀灭，未被消毒液杀灭的菌落平均比值为0.192%。通过对上述3次试验结果分析，可得出每次黑曲霉菌未被75%乙醇杀灭的菌落平均比值，从而计算出每次已被75%乙醇杀灭的菌落平均比值，进而算出已被75%乙醇杀灭的菌落总平均值。综合分析结果如表4所示。通过重复3次的试验数据统计，75%乙醇对菌悬液作用40min内，未被75%乙醇杀灭的菌落总平均比值为0.219%。第1次试验结果已被75%乙醇杀灭的菌落平均比值为99.817%，第2次试验结果已被75%乙醇杀灭的菌落平均比值为99.717%，第3次试验结果已被75%乙醇杀灭的菌落平均比值为99.808%，由此可得3次试验已被75%乙醇杀灭的菌落总平均比值为99.781%。

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试验讨论本次研究重复3次试验，3次试验结果数据有一定的差距，试验全过程均在生物安全柜内进行，需要用的试管、吸管、平皿等器具均通过湿热灭菌后方可使用，试验前开启紫外灯对生物安全柜灭菌消毒20min，消毒完毕待风机运行30min后进行试验。3次试验操作人员不变，操作时间、操作人员的动作