(高清版)GBT 42117-2022 羊泰勒虫病诊断技术

羊泰勒虫病诊断技术国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出。本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC!TC181)归口。本文件起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。1羊泰勒虫病诊断技术1范围本文件规定了羊泰勒虫病的临床诊断和综合判定的技术要求，描述了羊泰勒虫病病原(吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫)血涂片显微镜检测和聚合酶链式反应检测方法。本文件适用于羊泰勒虫病病原检测、泰勒虫隐性感染及临床病例的诊断。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析试验用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid)PBS:磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferedSaline)PCR:聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)TAE:核酸电泳缓冲液(Tris-Aceticacid-EDTA)5生物安全要求样品采集、处理及检测过程中涉及的实验操作，应符合GB19489的相关规定。6临床诊断6.1典型临床症状6.1.1动物精神沉郁，体温升高至40℃~42℃,呈稽留热。6.1.2眼结膜充血肿胀，贫血或可视黏膜黄染。6.1.3肩前和股前淋巴结肿胀，质地坚硬，触诊敏感。26.2典型病理变化6.2.2皮下有胶冻样浸润，黄染及点状出血。6.2.3肠系膜不同程度黄染，肠道出血坏死(见附录A中的A.1)。6.2.4全身淋巴结不同程度肿大，切面呈灰黄色，髓质有出血点。6.2.5胃浆膜、黏膜出血，黏膜有黄白色或暗红色结节(见A.2)。6.3流行特点6.3.1多发于4月～9月，流行于青海血蜱和长角血蜱(见附录B)分布区域。6.3.2患病动物体表可见蜱或有蜱叮咬史。6.3.3羔羊和外地引进羊多发；本地羊症状较轻，引进羊或改良羊常出现明显的临床症状。病畜出现典型临床症状(6.1)和典型病理变化(6.2),并符合流行特点(6.3),可判为疑似羊泰勒7血涂片显微镜检测7.1.1姬姆萨(Giemsa)染色液储存液，按照附录C中C.1配制。7.1.2姬姆萨染色液工作液，按照C.2配制。7.2耗材7.2.2载玻片。7.3仪器光学显微镜。7.4血涂片制备用剪毛剪剪除羊耳尖毛，针头刺破耳尖，取耳尖静脉血滴于玻片上，用推片推成有末梢的薄血涂片，并迅速晾干。7.5血涂片固定加甲醇于血涂片上，确保甲醇液体能够覆盖玻片上的红细胞，自然晾干后重复一次。7.6血涂片染色将姬姆萨染色液工作液滴加到甲醇固定好的血涂片上，室温染色30min后，用自来水充分冲洗掉残留的染色颗粒，吹风机吹干或自然晾干后待检。37.7显微镜检查血涂片上接近末梢位置滴加一滴香柏油，在1000倍(10×100)光学显微镜下观察100个视野。7.8结果判定7.8.1阳性：红细胞内观察到符合附录D的泰勒虫典型虫体时，可确诊。7.8.2疑似：红细胞内未见典型泰勒虫虫体，仅观察到少量点状或不规则形颗粒，判定为疑似感染。7.8.3阴性：未出现7.8.1和7.8.2的结果，判定为血涂片检测阴性。8PCR检测方法8.1试剂与材料除特别规定外，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682的要求。8.1.1商品化全血基因组提取试剂盒。8.1.22×PremixTaq酶混合液(商用),包含DNA聚合酶、缓冲液和2.5mmol/L的dNTP混合物。8.1.4琼脂糖(电泳级)。8.1.610mg/mL溴化乙锭(EB),按照C.4配制，或同类核酸染料。8.1.8DNA分子量标准品。8.1.10引物及引物配制：吕氏泰勒虫上游引物，Tlu-F:5'-GGTAGGGTATTGGCCTACTGA-3'吕氏泰勒虫下游引物，Tlu-R:5'-TCATCCGGATAATACAAGT-3'尤氏泰勒虫上游引物，Tui-F:5'-GGTAGGGTATTGGCCTACCGG-3'尤氏泰勒虫下游引物，Tui-R:5'-ACACTCGGAAAATGCAAGCA-3'引物用无RNase水稀释至10μM备用。8.1.11吕氏泰勒虫阳性对照：筛选梨形虫阴性羊，用吕氏泰勒虫感染，当红细胞染虫率达到5%以上时，采血并提取全血总DNA,稀释至1ng/μL作为吕氏泰勒虫阳性对照或按照附录E制备质粒作为阳性对照。8.1.12尤氏泰勒虫阳性对照：筛选梨形虫阴性羊，用尤氏泰勒虫感染，当红细胞染虫率达到5%以上时，采血并提取全血总DNA,稀释至1ng/μL作为尤氏泰勒虫阳性对照或按照附录E制备质粒作为阳性对照。8.1.13阴性对照：筛选泰勒虫阴性羊，采集颈静脉血，提取全血总DNA,稀释至1ng/μL作为阴性对照。8.2仪器设备8.2.2高速冷冻离心机(最高离心速度不低于12000r!min)。8.2.3生物安全柜。48.2.6水平电泳槽。8.2.7凝胶成像仪。采集待检羊颈静脉血液至含抗凝剂的采血管中，样品采集后可立即用全血基因组提取试剂盒提取DNA,或保存于2℃~8℃,但不应超过48h。如需长期保存，可将血液样品分装后一20℃保存，避免反复冻融。在样本制备区提取基因组DNA。采用商品化的全血基因组提取试剂盒提取DNA,提取步骤按照说明书进行。提取好的DNA立即进行PCR扩增或一20℃保存。8.5PCR反应体系及条件PCR反应体系应在洁净区配制后，在样本处理区加入待检DNA样本，并设置阴阳性对照。8.5.2吕氏泰勒虫PCR检测反应体系及条件PCR反应体系如下：——1μL10μmol/L的Tlu-R引物；——2μL的模板DNA;——8.5μL的无RNase水。瞬时离心后，置PCR扩增仪内进行扩增。扩增程序为：95℃预变性3min;94℃变性30s,55℃退火1min,72℃延伸1min,共35个循环；72℃延伸7min。8.5.3尤氏泰勒虫PCR检测反应体系及条件按照下列方法配制25gLPCR体系：——2μL的模板DNA;——8.5μL的无RNase水。瞬时离心后，置PCR扩增仪内进行扩增。扩增程序为：95℃预变性3min;94℃变性30s,58℃退火1min,72℃延伸1min,共35个循环；72℃延伸10min。8.6PCR产物琼脂糖凝胶电泳及成像中进行电泳，凝胶成像分析系统观察结果并拍照。5GB/T42117—20228.7结果判定8.7.1质控标准吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫标准阳性样品均扩增出380bp大小的特异性条带，标准阴性对照无扩增条带时，判为实验有效。符合8.7.1的条件下，待检样品在吕氏泰勒虫检测体系中扩增出380bp大小的条带，可判定为吕氏泰勒虫核酸阳性；待检样品在尤氏泰勒虫检测体系中扩增出380bp大小的条带，可判定为尤氏泰勒虫核酸阳性。按照附录F给出的PCR检测结果判定标准图进行判定。未出现380bp大小的条带，可判定为吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫核酸阴性。9综合判定9.1阳性符合6.4,并符合7.8.1或者8.7.2判定为羊泰勒虫病阳性。9.2隐性感染不符合6.4,但符合7.8.1或者8.7.2判定为羊泰勒虫隐性感染。9.3阴性不符合6.4,同时符合7.8.3和8.7.3时，判定为羊泰勒虫病阴性。6(资料性)泰勒虫病典型病理图片A.1感染泰勒虫后肠道病理变化泰勒虫感染会导致宿主肠系膜黄染、肠道出血，病理变化如图A.1所示。图A.1泰勒虫感染羊肠道病理图A.2感染泰勒虫后胃部病理变化泰勒虫感染会导致胃浆膜、黏膜出血及溃疡，病理变化如图A.2所示。a)胃黏膜出血及溃疡b)胃浆膜表面出血图A.2泰勒虫感染胃部病理图7(资料性)吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫传播媒介蜱图片B.1青海血蜱形态如图B.1所示。a)青海血蜱背面b)青海血蜱腹面B.2长角血蜱形态如图B.2所示。a)长角血蜱背面b)长角血蜱腹面8(规范性)试剂配制方法C.1姬姆萨染色液储存液姬姆萨染料0.5g、甘油33mL、甲醇33mL。将染料置研钵中，加少量甘油进行充分研磨后，加入全部甘油，55℃~60℃水浴加热1h～2h,期间不断摇动混匀。冷却至室温后加入甲醇，混匀储存在棕色瓶中室温静置6个月，三层滤纸过滤备用。C.2姬姆萨染色液工作液按每毫升无离子水加200μL姬姆萨染色液储存液进行配制，现配现用。C.3TAE电泳缓冲液的配制溶解，充分混匀后加双蒸水补齐至1000mL。1×TAE缓冲液：取10mL贮存液加490mL双蒸水即为1×TAE缓冲液。称取溴化乙锭1g,加蒸馏水定容至100mL,磁力搅拌充分溶解后，棕色瓶内室温保存。C.51.5%琼脂糖凝胶与凝胶块制备将琼脂糖1.5g放入100mL1×TAE缓冲液中，加热融化，温度降至60℃左右时，加入溴化乙锭或同类型核酸染料10μL,混匀后制备凝胶块。9GB/T42117—2022(规范性)吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫典型虫体形态D.1吕氏泰勒虫典型虫体形态红细胞内吕氏泰勒虫典型形态如图D.1所示。图D.1红细胞内吕氏泰勒虫典型形态图(箭头所示)D.2尤氏泰勒虫典型虫体形态红细胞内尤氏泰勒虫典型形态如图D.2所示。图D.2红细胞内尤氏泰勒虫典型形态图(箭头所示)(规范性)吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫阳性质粒制备E.1吕氏泰勒虫18SrRNA基因片段(389bp)GGTAGGGTATTGGCCTACTGAGGCAACGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCACCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACGGGGCTTAATGTCTTGTAATTGGAATGATGGGAATTTAAACCTCTTCCAGAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAATTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTCTGCTGCATTGCATCTTCTTTTTGATGAGTTGGTGTATTGTGGCTTATTTCGGATGATACTTGTATTATCCGGATGAE.2尤氏泰勒虫18SrRNA基因片段(388bp)GGTAGGGTATTGGCCTACCGGGGCAACGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACGGGGCTTAACGTCTTGTAATTGGAATGATGGGAATCTAAACCTCTTCCAGAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAATTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTCTGCCGCCCCGCCTCTGCCCCTCGACGGGCGTTTGCGCCGCGGCTTTTTCGGATTATGCTTGCATTTTCCGAGTGTE.3制备吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫阳性质粒按照E.1和E.2提供的序列合成基因片段，将合成的基因片段与克隆载体pGEM-Teasy质粒4℃过夜连接(按照相应的说明书操作);重组后的质粒转化至JM109或Trans5α感受态细胞中，LB固体培养基中37℃过夜培养后挑取单克隆菌，在LB液体培养基中37℃过夜培养后取部分菌