四类方法教你检测水产品中的喹诺酮类药物残留

摘要喹诺酮类药物是人工合成的一类广谱抗生素，广泛应用于水产养殖领域。随着我国水产养殖业的快速发展，因喹诺酮类药物抑制和杀灭细菌的能力较强，具有不错的抗菌活性、与其他常用抗菌药物不易产生交叉耐药性，并且具有低毒副作用、低成本等优势，在水产品的细菌性疾病防治上被广泛选择使用。由于目前水产用药仍然存在滥用的情况，对食品安全和生态环境方面存在一定威胁，故对喹诺酮类药物残留的检测研究具有非常重要的意义。为此，本文阐述了喹诺酮类药物在水产养殖方面的应用和残留情况，综述了喹诺酮类药物残留的前处理方法和现有的检测技术，并对现有的样品前处理方法和检测方法进行了比较分析，旨在为水产品中喹诺酮类药物残留检测研究提供理论参考。1背景中国是全世界最大的水产养殖国家，每年水产养殖产量占全球总产量的60%以上，但也存在一些突出的问题，如在水产养殖过程中，由于滥用抗生素的导致的药物残留现象比较严重。喹诺酮类药物，因其抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透力强，且价格低廉被广泛应用于可食性动物，但残留可导致人体内病原体的耐药性，所以喹诺酮类药物在食品中早就规定了最大残留量。残留检测也已成为了研究重点。本文对喹诺酮类药物残留的分析方法进行了综述，以期为建立健康健全的水产养殖安全检测体系提供参考。

2喹诺酮类药物在水产养殖方面的应用喹诺酮类，又名吡酮酸类或吡啶酮酸类，是一类含4-喹诺酮基本结构的人工合成抗菌药物。随着我国水产养殖业的迅速发展，因为喹诺酮类药物能够在细菌DNA复制过程中引发解链和重聚异常现象，进而对细菌造成不可逆的损伤，所以被广泛应用于预防和治疗水生生物常见的各种细菌性疾病，包括淡水类出血性败血症、腐皮病、肠炎病、烂鳃病、牛蛙红腿病等。但由于长期用药导致喹诺酮类抗生素在动物性食品源中残留增多、易出现耐药性、影响生物圈的生态效应，并且喹诺酮类抗生素通过食物链最终残留在人体，近年来对人体产生的健康危害引起了高度关注。总体而言，食用有喹诺酮类药物残留的水产品会损害人体健康，容易诱导人类病原微生物产生耐药性和抗药性，影响该药物的临床疗效，严重时还会对食用者产生直接毒性及潜在“三致”作用。据资料显示，喹诺酮类药物在动物源性食品制品中被广泛检出，且在水体环境、沉积物、土壤中也普遍被检出。该类药物在沉积物和土壤中具有稳定性，半衰期长，难降解，可造成直接污染。且该药物还会产生严重的生态毒性，通过对土壤和沉积物中微生物的耐药性产生压力,诱导产生了抗生素抗性基因和耐药性细菌。同时，喹诺酮类药物具有广谱抗菌性，还会抑制水环境中和养殖动物肠道中的有益微生物、目标细菌以外的微生物，会使得水生动物体内和水环境的微生态平衡被打破、水环境不断恶化、水质状况等级下降、水生物机体内出现消化吸收障碍，从而引发新的疾病。因此，喹诺酮类药物引起的环境污染问题已成为近年来国内外的研究热点。根据不同动物品种、组织群体和药物类别国际食品法典委员会、欧盟、日本及中国均制订出喹诺酮类药物的最高残留限量在10～6000μg/kg。

3喹诺酮类药物残留情况全球各地市场销售的鱼类虾类中普遍存在喹诺酮类药物残留情况。林功师采用超高效液相色谱-串联质谱法测定厦门市水产品批发市场销售的12种常见鱼类样品，136份样品检出率2.21%；黄志英等采用液相色谱-串联质谱法测定江西省市售鲜活淡水鱼和淡水虾各32份，其中淡水鱼的检出率均为3.13%，淡水虾的检出率为9.38%；徐文珍等调查发现台州市2018—2020年淡水鱼、淡水虾、养殖黄鱼中喹诺酮类药物总检出率分别为59.4%、55.3%、91.9%；采用酶联免疫吸附法测定加利亚旧扎戈拉地区的鱼类样品中氟喹诺酮类药物残留的存在情况，其中44.3%的淡水和42.9%的海水鱼样品中检出为阳性且部分鱼类样品中氟喹诺酮类药物含量较高。这表明尽管各国监管部门加强了对使用的管控和对畜禽产品、水产品和蜂产品定期抽样监测，但不科学、不合理的用药现象仍然存在，因此在水产养殖、适应性短期饲养和销售各个方面仍需加强对喹诺酮类药物的使用管理，建立准确高效的喹诺酮类药物检测方法也显得尤为重要。

4样品前处理技术开展检测分析必须经过样品前处理，样品前处理直接关系着分析检验的成败，检测的成本和效率也与此相关。所以为提高检测方法的灵敏度和降低检测限，检测前应尽可能去除样品中的杂质。常见的前处理技术主要有：液-液萃取技术、分散液液微萃取法、固相萃取技术和QuEChERS技术等。4.1

液-液萃取技术液-液萃取技术，又称溶剂萃取或抽提，常用于样品中被测物质与基质的分离。其原理是利用样品中不同组分在溶剂中的溶解度或分配比不同，通过在液体混合物中加入与其不相混溶或稍相混溶的选定溶剂来重新分配提取待测物，从而消除干扰物质，最终达到分离、提取或纯化的目的。4.2

分散液液微萃取法分散液液微萃取(DLLME)在前处理技术领域中是一种新颖的技术，具有简便、高效、快捷等优势，并能够显著减少有机溶剂的消耗，是2006年以样本溶液、萃取剂(与水互不相溶)和分散剂(与水相和萃取剂混溶)组成的三重溶液系统为基础开发的一种新型液相微萃取技术，可以说是微型化的液-液萃取。该技术使用注射器将萃取剂与分散剂混合并迅速注入样本溶液中，以产生高强度的瑞流，使小液滴形式的萃取剂完全扩散到样本溶液中，形成了萃取剂、分散剂和样本溶液三组分的乳浊液体系。从而达到了简化操作、加快速度、降低成本、提高回收率、高富集因子等目的，因此本方法在很多领域中得到了广泛的应用。4.3

固相萃取技术基于液相色谱原理，固相萃取技术（SPE）可近似看作一个简单的色谱过程，该方法是根据萃取组分和样品基质及其他成分在固定相填料上作用力强弱的不同而使他们彼此分离，不仅如此还可以在加入样品溶液的同时，有选择性地吸附其中存在干扰性的杂质，使得目标化合物能够直接流出，以达到分离、纯化和富集的目的。固相萃取技术与液-液萃取技术相比，所消耗的有机溶剂量少，回收率更高，检测灵敏度更好。因此，该技术优于液-液萃取技术。于宏杰等对新疆白斑狗鱼中5种喹诺酮兽药残留进行测定研究了3种常用固相萃取柱的不同影响，并采用超高效液相色谱质谱联用仪进行测定，结果表明，在5～100μg/L的线性范围内，Poly-SeryHLBPro、Poly-SeryHLB、WatersHLB这3种固相萃取小柱加标回收的平均回收率分别为91.0%～103.0%、85.5%～95.6%、86.6%～97.3%，3种固相萃取柱稳定性RSD分别为0.36%～3.05%、0.19%～1.75%、0.56%～1.97%。由此得出，3种固相萃取柱都能够用于水产品中喹诺酮类抗生素残留的检测。4.4QuEChERS技术QuEChERS法是一类快速、简便、经济、高效、耐用和安全的样品前处理方法，于2003年被开发后常用于植物产品中农药残留量的样品前处理。通过持续优化，目前该方法开始在动物产品兽药残留检测中得到应用。其原理与高效液相色谱法相似，都是通过基质和待测物间不同的相互作用，但QuEChERS法极大提升了样品前处理速度。其基本步骤是先用有机试剂提取分离，再加入无机盐，随着盐溶液浓度增大，蛋白质逐渐沉淀，以此来除去样品中的水和蛋白质，再添加吸附剂离心取得上清液浓缩后复溶，最后直接进行检测。杨金易等建立了水产品中恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星3种兽药多残留的新型分析方法，是以QuEChERS前处理技术结合酶联免疫快速检测。样品通过90%乙腈(1%乙酸)均质提取后离心，上清液依次用C18柱净化、将蛋白静置沉淀后用于测定，该前处理方法效率高、成本低、实用性强。测试曲线线性范围为0.107～177.896ng/mL，检出限为0.0087μg/kg，IC50值为4.34ng/mL。样品批内和批间平均回收率分别为94.10%、93.70%，批内变异系数为4.09%～8.41%，批间变异系数为2.78%～7.99%。通过对检测结果分析与HPLC的相关系数R2=0.9897，可以得出酶联免疫检测方法及样品前处理方法满足于喹诺酮类药物的多残留检测。

5喹诺酮类药物的检测方法除了正确有效的前处理，完成样品检测还需要依靠多种技术融为一体的、精准的检测技术。目前针对水产品中喹诺酮类药物残留的检测技术主要包含：微生物法、免疫分析法、色谱法、毛细血管电泳法等。5.1

微生物法利用对抗生素敏感的细菌，通过在指示剂显色或观察抑菌圈来检测药物残留，这种方法被称为微生物检测法。该方法的原理是利用抗微生物药物对敏感微生物具有良好的杀灭或抑制效果，当抗微生物药物的浓度低至一定限度后，这种效果将不再表现。根据不同的药物含量，对药物敏感的微生物会表现出不同大小的抑菌圈，从而来检测药物残留量。不同于传统的方法，该方法更为快速、便捷、可同时检测大量样品、易于结果判定，是对现有检测方法的一种有益的补充和完善，极其适合在生产、销售、流通等非实验室条件下作为初筛方法使用。胡鲲等针对水产品中恩诺沙星残留，通过筛选药物敏感菌株和显色剂，利用腾黄八叠球菌为指示菌株，使用氯化三苯四氮唑为显色剂，建立了一种基于显色反应来判断结果的微生物检测方法。阳性样品呈肉眼可辨的红色，阴性样品呈无色，最低检测限可达50μg/kg。经酶联免疫法(最低检测限可达12μg/kg，回收率在74.25%～93.38%)和高效液相色谱法(最低检测限可达5.0μg/kg，回收率在78.20%～91.27%)验证，该方法准确、可靠。5.2

免疫分析法1）胶体金法。免疫胶体金技术（GICA）的基本原理即吸附原理为：胶体金的负电荷存在于颗粒表面，因静电作用与蛋白质分子的正电荷基团组成牢固的结构，所以不会影响到蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合外，还可以与很多其他生物大分子结合。宗婧婧等采取胶体金免疫层析法利用胶体金本身的显色特点结合免疫层析技术检测了水产品中15种喹诺酮药物的残留情况。水产品试样使用0.1%甲酸-乙腈溶液提取，正己烷脱脂，胶体金试纸条检测，检测耗时短，只需3～5min。且15种喹诺酮类药物的检出限在0.35μg/kg。400批次样品检测后发现9批次阳性样品，经超高效液相色谱-串联质谱法证实后，所得检测结果一致。胶体金技术具有方便快捷、特异性强、高度稳定、不需要配备特殊设施和试剂、产生结果一目了然等优点，故此特别适用于广大基层检验人员使用并且在大批量检测和大面积普查时可以起到关键作用，具有巨大的发展潜力和广阔的应用前景。2）酶联免疫法。酶联免疫法（CLEIA），全称酶联免疫吸附剂测定法，是酶免疫分析中最常用的方法，该测定法利用相关联的酶与免疫复合物发生酶催化反应将待测物与酶连接，通过底物与酶作用生成有色产物，对待测物进行定量反应。王敏等采用间接竞争酶联免疫法检测猪肉中氯丙嗪的残留量。最低检测限为0.51ng/mL，线性检测限度为1.37～111.11ng/mL。线性回归直线方程为y=－1.2526x+2.8532，2个变量间的线性关系相关系数R2为0.9866，总变差系数（CV）为6.97%，空白猪肉加标回收率为96.90%～118.79%。试验证实该方法特异性强，灵敏度高，精密性、重现性和准确性相对较好，可适用于快速检测猪肉组织中氯丙嗪的残留。酶联免疫法因具有快速、灵敏、简便和特异性强等优点，适合大量样品的初步快速筛选检测，因此适用于基层检测站使用。5.3

色谱法色谱法具有高分辨率、高准确度和高灵敏度的特点，能够检测的药物种类多。但其分析过程复杂、维修保养费用高且需专业人员操作，仅适用于喹诺酮类药物残留的常规监测和实验室检测。1）高效液相色谱法。高效液相色谱法（HPLC），又称高压液相色谱、高速液相色谱、高级柱色谱等。高效液相色谱法以一种液体为流动相，采用高压输液系统供给一种将不同的极性或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相装入装有固定相的色谱柱中，色谱柱中的组分分离后，它们进入检测器进行检测，以实现分析试样。高效液相色谱法具备“四高一广”的特点，即高压、高速、高效、高灵敏度和应用范围广，是较为常用的喹诺酮类药物实验室检测方法。Jin等建立了淡水鱼中达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星和二氟沙星残留的高效液相色谱检测方法。鱼样采用甲醇-水-乙酸(2/8/0.01，V/V/V)提取，C18固相萃取柱。以甲醇+丙二酸-氯化镁水溶液为流动相，30℃梯度洗脱，进样量20μL。紫外检测器波长为280nm。4种药物的线性范围为0.1～10μg/mL，在0.5和4.0μg/kg水平下，4种药物的平均回收率为79.81%～92.03%，RSD为1.03%～4.07%。DAN、ENR、SAR和DIF的限量分别为0.1、0.1、0.05和0.05μg/kg个体。该方法简单、高效，适用于鲶鱼、鲫鱼和鲤鱼等淡水鱼类的分析。2）超高效液相色谱法。超高效液相色谱（UPLC）相较于高效液相色谱法（HPLC），对于分析物的分离能力更强，还可用于检测分离难度大的药物，能够有效减少流动相的使用并缩短检测时间。3）高效液相色谱-串联质谱法。高效液相色谱-质谱技术（HPLC-MS/MS）是基于液相色谱（LC）的分离原理来进行分离组分，分离后再以质谱仪（MS）作为检测器进行检测的一种方法，具体工作原理为样品借助液相色谱系统进样，分析物通过接口流出色谱仪至离子源位置，并不断电离，在离子不断聚集的过程中，根据质量与结合的比例进行分离处理，分离之后的离子信号被转化成电信号，传输到计算机数据处理系统，通过对质谱峰的实际情况监测来进行分析。虞冰等采用高效液相色谱-串联质谱法对水产品中15种氟喹诺酮类兽药的残留情况进行了检测，结果显示15种氟喹诺酮类兽药的检出限为1.0μg/kg，定量限为2.0μg/kg。氟喹诺酮类兽药在2.0～80.0ng/mL时线性关系良好，平均回收率范围为77.33%～100.30%。试验表明，液质联用法测定15种氟喹诺酮类方法操作简便，提取步骤简单，可实现15种氟喹诺酮类兽药残留的快速检测。液质联用法分析线性范围广，检测灵敏度高，检测限低，能够有效地进行定性以及定量，已经成为近年来最为常用的实验室检测方法。4）超高效液相色谱-串联质谱法。超高效液相色谱-串联质谱技术（UPLC-MS/MS）色谱柱相较于于高效液相色谱-串联质谱技术，粒径更小，更有利于物质的分离。Julia等在样品的前处理中使用酶微波辅助液体萃取技术，通过超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法检测到小龙虾体内包括多种FQs在内的21种抗生素的残留，回收率达71%～106%，检出限为0.6～12μg/kg。5.4

毛细管电泳法毛细管电泳法（HPCE）又称毛细管电分离法，是近些年发展起来的一项新的实验分析技术，该方法是以弹性石英毛细管为分离管道，样品中各组分在高压直流电场的作用下产生不同的迁移速度，从而实现分离的一类电泳分离分析技术。田慧勇等采用毛细管电泳法测定鱼肉组织中的诺氟沙星和环丙沙星。结果表明：诺氟沙星和环丙沙星的检测范围为0.10～500μg/g，其R2值分别为0.9994和0.9986，检测限分别为0.04μg/g和0.03μg/g。毛细管电泳法具有分离效率高、样品用量少、易操作、不受缓冲液pH值影响等优点，利于实际样品的分析，是目前自动化程度较高的分离方法之一。