富血小板血浆改善子宫内膜容受性的研究进展

摘要胚胎着床和妊娠的维持是多因素参与且相互影响的过程。子宫内膜容受性异常是反复种植失败患者的重要病因之一。目前提高内膜容受性的方法主要有宫腔搔刮、各种药物宫腔灌注、封闭抗体治疗及针灸等，治疗后受益有限。近年来有研究采用富血小板血浆（platelet-richplasma，PRP）宫腔灌注的治疗方法试图对种植窗期子宫内膜进行调节，受到众多关注。本文对PRP在改善子宫内膜容受性方面的应用进行了综述，以期为临床治疗及未来科学研究提供参考。【关键词】

反复种植失败；子宫内膜容受性；富血小板血浆

子宫内膜容受性是指子宫内膜在雌孕激素作用下发生一系列组织结构形态变化，从而允许囊胚定位、黏附、侵入并使胚胎着床的能力，同时需要众多生物分子进行精密的调控。通过基因芯片技术研究显示，与正常妊娠相比，种植失败患者内膜种植窗期多种细胞因子的表达存在显著性差异，如白介素（interleukin，IL）、血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）、白血病抑制因子（leukemiainhibitoryfactor，LIF）等［1］，这些活性物质形成复杂的且动态变化的微环境直接或间接影响胚胎种植。因此目前在临床实践中，有许多改善子宫内膜容受性的治疗方案。子宫内膜薄多采用雌激素治疗［2］；枸橼酸西地那非、小剂量阿司匹林等改善内膜局部微循环［3］，对于内膜息肉、宫腔粘连等解剖学异常者一般行宫腔镜下粘连分解术和内膜刺激术［4］；此外，宫腔灌注作为一种简单易行、局部高效的治疗方法，在各生殖中心都有不同程度的应用。灌注的药物包括粒细胞集落刺激因子（granulocytecolony-stimulatingfactor，G-CSF）、人绒毛膜促性腺激素（humanchorionicgonadotrophin，hCG）及外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells，PBMCs）等［5-7］，均在一定程度上能够改善子宫内膜容受性。富血小板血浆（platelet-richplasma，PRP）是采用离心的方法从自体全血中分离出的血小板浓缩物，富含高浓度血小板、细胞因子及蛋白质，能够促进细胞增殖分化，促使组织修复愈合，同时由于其制备简单且为自体成分，不发生免疫排斥反应等优点，目前已被用于调节子宫内膜局部血液循环及免疫状态，并取得一定治疗效果。本文针对PRP的临床应用的研究进展进行综述，以期为临床治疗及未来科学研究提供参考。一.PRP分类及作用机制PRP并非某一种成分和浓度完全确定的物质，实际上它是一类由全血离心制备而成的富含血小板的制品的统称。PRP的制备方式多种多样，成分也不尽相同，因此将PRP进行分类是探讨其临床应用价值的基础。目前较为公认的分类方法，可按照白细胞和纤维蛋白含量的不同分为4类。①纯富血小板血浆（pureplateletrichplasma，P-PRP），含血小板、低密度纤维蛋白网而无白细胞；②富白细胞和血小板血浆（leukocyteandplateletrichplasma，L-PRP），含血小板、低密度纤维蛋白网及白细胞；③纯富血小板纤维蛋白（pureplateletrichfibrin，P-PRF），含血小板、高密度纤维蛋白网而无白细胞；④富白细胞和血小板纤维蛋白（leukocyteandplateletrichfibrin，L-PRF），含血小板、半数白细胞（主要是淋巴细胞）和高密度纤维蛋白网［8］。虽然这四类PRP的成分及生理作用不尽相同，但其制备都离不开采血、抗凝、离心的基本过程。PRP中含有高浓度血小板，血小板在激活后可释放多种细胞因子，包括血小板源性生长因子（platelet-derivedgrowthfactor，PDGF）、表皮生长因子（epidermalgrowthfactor，EGF）、胰岛素样生长因子-1（insulin-likegrowthfactor-1，IGF-1）、转化生长因子-β（transformgrowthfactor-β，TGF-β）、VEGF等［9］，这些因子可刺激细胞增殖、合成和代谢，促进胶原蛋白Ⅱ、蛋白聚糖和细胞外基质的合成，从而促进骨与软组织的修复［10］。此外血小板还可释放一些炎症反应抑制因子，如IL-4、IL-10、IL-13和干扰素（interferon，IFN）-γ等，这些因子可以抑制炎症反应，保护细胞免受炎症反应的损伤，同时促进巨噬细胞、中性粒细胞的趋化，直接或者间接地杀灭、抑制病原菌，从而控制感染，在机体免疫防御中起重要作用［11］。VEGF则可促进血管生成和内皮细胞的有丝分裂［9］。纤维蛋白原在激活后交联形成纤维蛋白，积聚形成网状结构，提供细胞黏附、迁移的支架。因此PRP不仅可以促进组织修复，还可以抑制炎症反应、控制感染，同时为组织修复提供支架［12］。二.PRP在改善子宫内膜容受性的治疗中的应用现状近年来关于细胞因子、基因、子宫内膜分泌物蛋白组学等微观指标评价子宫内膜容受性的研究日新月异，传统影像学及组织学检查的价值也不断被证实。因此通过准确判断子宫内膜状态，寻找改善子宫内膜容受性的临床方法并进行个体化移植是提高辅助生殖技术成功率的重要突破点。1.PRP在反复种植失败（repeatedimplantationfailure，RIF）中的应用：RIF是临床上常见的问题，处理非常棘手，一直备受临床医师的关注，并成为生殖医学研究的热点之一。目前对于RIF的定义，中国临床治疗专家基本达成共识，即“年龄<40岁，经历3次及以上移植周期，且累积移植至少4枚卵裂期优质胚胎或3枚优质囊胚而未获临床妊娠者”。RIF的病因复杂多样，涉及胚胎质量、内膜容受性、自身免疫等多方面因素，其中约2/3的种植失败是由于子宫内膜容受性不良或病理性异常造成。2016年Nazari等［13］研究者将17.5mL自体外周静脉血与2.5mL枸橼酸盐抗凝液混合，采用二步离心法获得比外周血小板浓度高4~5倍的PRP，然后取0.5mL经导管注入宫腔，结果显示在20例RIF患者中，有18例妊娠，其中1例早期流产，1例为葡萄胎妊娠，临床妊娠率为80%，首次表明应用PRP治疗RIF患者能够提高妊娠率。在此基础上，2018年Mehrafza等［14］研究报道，回顾性分析123例RIF患者宫腔灌注L-PRP和G-CSF，结果显示宫腔灌注G-CSF临床妊娠率为21.4%，宫腔灌注L-PRP治疗临床妊娠率为40.3%，差异具有统计学意义。2019年Coksuer等［15］回顾性分析70名RIF患者行冻融胚胎移植（frozen-thawedembryotransfer，FET）治疗结果表明，在移植前48h宫腔灌注一次离心获得的PRP混悬液1mL，临床妊娠率（12%）和活产率（14%）与对照组（8%，6%）相比显著增加，差异具有统计学意义，白细胞数为（992.45±212.85）×103/mL。Dieamant等［16］同样采用二步离心法方法制备PRP，采用前瞻性研究在移植前48h宫腔灌注PRP0.7mL，同时联合皮下注射G-CSF（300μg/0.5mL），结果显示临床继续妊娠率显著提高，流产率降低，初步提示在改善RIF患者子宫内膜容受性中，两者联合治疗具有一定作用，且风险性降低。推测其作用机制为PRP含丰富的细胞因子和生长因子，能够刺激子宫内膜血管网中各种组织蛋白的表达，以自分泌或旁分泌的方式促进子宫内膜腺上皮细胞的表面分子结构和功能发生一系列变化，增加子宫内膜整合素αvβ3的表达，介导内膜细胞-基质细胞间、胚胎-内膜间的联系，促进内膜的生长与胚胎发育的同步化，改善子宫内膜容受性，最终有利于胚胎植入。2.PRP在薄型子宫内膜的应用：在人类生殖周期中，“种植窗”期子宫内膜厚度是反映内膜增生能力的重要指标，足够的内膜厚度是确保胚胎种植成功的关键。研究证实［17］：获得临床妊娠的最佳内膜厚度为9~14mm，一般认为内膜厚度<7mm胚胎种植率降低，因此提高子宫内膜厚度对妊娠结局和新生儿预后都具有积极意义。2015年常亚杰等［18］首次报道经二步法离心获得PRP中白细胞浓度为24000~37000/μL，在月经周期的第10日宫腔灌注0.7~1mLPRP，每3d重复一次，结果表明宫腔灌注PRP可促进薄型子宫内膜患者的内膜生长并改善妊娠结局。目前已有多项研究表明，薄型子宫内膜患者经PRP宫腔灌注治疗后子宫内膜厚度、胚胎种植率、妊娠率及活产率显著增加，差异具有统计学意义［19-21］。体外实验表明，活化的PRP能够协同作用激活血小板源性生长因子受体/磷酸酰基醇3-激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶/核因子κB信号通路，从而提高旁分泌水平，增强细胞耐受不良环境的能力，促进人子宫内膜上皮细胞，子宫内膜间质成纤维细胞及子宫内膜间充质干细胞迁移、增殖和分化［22-23］。众所周知，组织的血液供应是影响新生组织增生和重建的主要因素，而血管再生是维持局部血液供应的物质基础，主要靠血管内皮细胞的增殖来实现。最近研究显示，PRP中含有高浓度的VEGF，对血管的形成、维持血管内皮的完整性和通透性具有极其重要的作用［24］。宫腔灌注PRP后，通过多普勒超声测量子宫内膜血流搏动指数、阻力指数和内膜下血流分型发现，到达子宫内膜的血管信号数量显著增加，提示宫腔灌注PRP能够增加子宫内膜下血液循环，促进子宫内膜生长，从而改善子宫内膜容受性，提高妊娠率。3.PRP在慢性子宫内膜炎的应用：子宫内膜炎感染的常见微生物包括链球菌、棒状杆菌、大肠杆菌、粪肠球菌、白色念珠菌及支原体等。绝大多数慢性子宫内膜炎患者无明显临床表现，其诊断需要依靠宫腔镜检查、组织病理学证据和细胞培养［25］。Kushnir等［26］研究表明，根据McQueen等［27］报道的免疫组织化学诊断指标，55例RIF患者行内膜活检，其中25例（45.5%）具有明确的慢性子宫内膜炎依据；病理学结果显示，炎性内膜细胞及间质成纤维细胞CD138表达增加，降低了内膜在分泌期接纳胚胎的能力。2016年Marini等［28］体外实验分析了PRP对牛子宫内膜炎症的作用，推测其可能成为体内治疗子宫内膜炎的潜在方法，进一步实验表明，宫腔灌注PRP作为一种炎症反应的免疫调节剂，能够减少多形核中性粒细胞进入宫腔，预防宫腔积液的产生，进而调节局部炎症反应［29］。2019年临床研究报道，宫腔灌注PRP对治疗慢性子宫内膜炎有积极作用［30］，其原因可能为①血小板可作为炎性反应的免疫调节剂，下调促炎基因的表达，其衍生因子的释放可使促炎细胞凋亡增加，前列腺素、促炎细胞因子（IL-1、TNF-α）和基质金属蛋白酶等因子的表达减少，并使IL-1受体拮抗剂和肿瘤坏死因子受体（TNF-R）等抗炎分子的表达增加，从而发挥控制炎症的作用；②既往部分学者认为PRP中含有的白细胞成分可增强局部抗感染能力，但目前仍然缺乏有效数据支持［31］，其在不同的PRP制剂中所起的作用和包含的问题也一直争论不休。体外证据表明自体血浆经一次离心后，L-PRP中白细胞计数为（29.79±5.89）×103/μL，血小板计数为（952.95±174.25）×103/μL，对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌及白色念珠菌等微生物表现出一定的抗菌作用，可能与其分泌的血小板抗菌蛋白有关［32］。目前已知至少7种人类血小板抗菌蛋白，但在现有文献中，关于其结构和功能的信息很少，亟待进一步研究分析。因此，基于以上研究资料，针对规范抗生素治疗失败的子宫内膜炎，临床上可根据PRP的抗菌特性获得高浓度制剂行宫腔灌注治疗，从而激活抗炎系统，改善子宫内膜免疫微环境，提高内膜容受性，促进胚胎着床。三.总结目前PRP已广泛应用于医学众多领域，且收效良好，在改善子宫内膜容受性方面，初步获得满意的临床效果，但必须指出，作为一种新的治疗方法，PR