微生物学实验五（二）土壤中微生物的分离纯化及观察

实验五土壤中微生物的分离纯化与活菌计数

目的要求1.掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。2.观察并识别微生物的菌落特征（群体形态）。（一）微生物的分离纯化及观察基本原理

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

1.简易单细胞挑取法（简易单孢子分离法）2.平板分离法

选择适宜的培养基，微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个或几个细胞繁殖而成的集合体。挑取单菌落可获得一种纯培养。方法：稀释涂布平板法、平板划线分离法器材分离源：自采集土壤样品培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，高氏Ⅰ号培养基、马丁氏（孟加拉红）培养基溶液或试剂盛4.5ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。仪器或其他用具振荡器，无菌培养皿，无菌吸管，接种环，电磁炉，培养箱，吸耳球等。1、编号：取无菌平皿１８个。另取无菌水４支，依次标明10-2、10－3、10-4、10-5。2、倒平板：分别将三种培养基溶化后，冷却至55～60℃时，每种培养基各倒６皿，标注培养基名称。其中，高氏Ⅰ号培养基在倒入前需先添加１０滴10%的苯酚。一、稀释涂布平板法（全组完成）3、制备土壤稀释液

0.5ml各4.5ml无菌水各取稀释样0.１ml涂布放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只接触一个稀释度。牛肉膏平板马丁氏平板10－210-310-410-510-110-210-310-410-5

0.5ml0.5ml0.5ml高氏Ⅰ号平板

４、涂布

５、培养

将高氏Ⅰ号平板、马丁氏平板倒置于28℃培养３～５d，牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃培养培养1～2d。

６、菌落观察

观察并描述土壤样品中分离到的细菌、放线菌、霉菌的菌落特征。

７、挑菌落将培养出的单菌落进行斜面接种，并分别置37℃和28℃温室中培养，此后镜检是否为单一微生物。若有杂菌，继续分离纯化。

二、平板划线分离法（个人完成）1、倒平板：将３种培养基溶化后，各倒一皿。并用记号笔标明培养基名称、样品编号、个人学号等。2、划线：分别挑取土壤样品中10－1的土壤悬液一环，在三种平板上划线，以分离细菌、放线菌、霉菌。

分区划线、连续划线分区划线（适用于浓度较大的样品）连续划线（适用于浓度较小的样品）3、培养将高氏Ⅰ号平板、马丁氏平板倒置于28℃培养３～５d，牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃培养培养1～2d。4、菌落观察５、挑菌

挑取单个菌落接种到斜面上培养，此后镜检是否为单一微生物。若有杂菌，继续分离纯化。实验结果

(P３4五、１.(２、３)

你所做的涂布平板法和划线法是否较好地得到了单菌落？如果不是，请分析其原因。在不同的平板上你分离得到了哪些类群的微生物？简述它们的菌落特征。思考题如何确定平板上某个单菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。(P３4五.2.(1))如果一项科学研究内容需从自然界中筛选到能产高温蛋白酶的菌株，你将如何完成？请写出简明的实验方案。(二)、平板菌落计数法目的要求学习平板菌落计数的基本原理和方法。基本原理通过将样品制成均匀的一系列不同稀释度的稀释液，使样品中的微生物细胞充分分散，成单个细胞存在，再取一定量的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特定的选择性培养基内。统计数量时，根据稀释倍数与取样量、平板上长出的菌落数计算出每克或每毫升样品中的微生物数（CFU）。实验器材菌种：大肠杆菌菌悬液培养基：牛肉膏蛋白胨培养基仪器或其他用具：1mL无菌吸管，无菌平皿，盛有4.5mL无菌水的试管等。两种计数方法倾注法（本次实验）涂布法操作步骤（全组完成）1.编号：取无菌平皿9个，分别表明10－4、10-5、10-6（稀释度）各三套。另取无菌水6支，依次标明10－1、10-2、10－3、10-4、10-5、

10-6。七支无菌吸管也依次编号。10-410-510-6原样10-110-210-310-410-510-60.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.2ml0.2ml0.2ml2.稀释:3.取样0.5ml4.倒平板：倒入融化后冷却至45℃的培养基15～２５ml，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀。5.培养：37℃倒置培养48h。６.计数：选择每个平板上长有30~300个菌落数的稀释度计算样品含菌量。实验结果P34表格依据实验结果，分析本次数据是否可靠。计算每毫升大肠杆菌菌悬液的含菌量。思考题（P34（3）（5）（6）（７））

为什么熔化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板？要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？当你的平