尿蛋白电泳及尿本周蛋白检测在肾病中的应用

血清蛋白电泳及免疫固定电泳

在免疫球蛋白疾病检测中的意义尿蛋白电泳及尿本周蛋白检测在肾病中的应用

电泳技术由于操作方便,成本低廉,目前已成为许多实验室进行体液(血清,尿液,脑脊液…)分离、分析的常规方法之一蛋白电泳是一项用途广泛的检测技术,可用于多种疾病的检测(肝硬化,肾病综合症,多发性硬化症,血红蛋白病,单克隆免疫球蛋白疾病…）

目前,尚没有一种方法可以取代电泳技术用于检测多发性骨髓瘤中出现的单克隆免疫球蛋白(M蛋白)CapillaryelectrophoresisAgarosegelelectrophoresis

蛋白电泳血清蛋白电泳(SPE)是多发性骨髓瘤样品中单克隆免疫球蛋白的唯一检测方法使用范围和检测原理电泳技术就是利用在电场的作用下,由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小,形状等性质的差异,使带电分子产生不同的迁移速度,从而对样品进行分离,鉴定或提纯的技术.在生化检测中,主要用于分离各类蛋白分子.正常的电泳图谱经过毛细管电泳后,血清蛋白将会被分离成6个条带并同时标注出检测结果a-1antitrypsinHaptoglobinTransferrina-1acidglycoprotein

a-2macroglobulinHemopexinAlbuminGammaBeta-2Beta-1Alpha-2Alpha-1C3complementGammaglobulins毛细管血清蛋白电泳图谱结合其他检测结果,可以确认炎症、肝炎、肝硬化、肾病等疾病

对出现临床症状的疑似骨髓瘤患者进行电泳检测单克隆免疫球蛋白可以检出早期无症状骨髓瘤患者对骨髓瘤疾病进行随访,监测疗效血清蛋白电泳可以帮我们解决如下问题

溶血

低免疫球蛋白血症

抗胰蛋白酶缺乏

自身免疫病

蛋白流失,营养不良

肾病综合症

+

肝病、肝硬化

高Ig症

慢性炎症

急性炎症

β-

bridgeSplitββα-2α-1AlbTP,g/dL

多种疾病的筛查

A1ATOROHPT

急性炎症电泳图谱

Alba1a2b1b2gA1ATOROHPTIncreaseofpolyclonalIgAinbeta2andGingamma

慢性炎症电泳图谱

总蛋白浓度出现明显下降,低于60g/La2macroglobulinlipoproteinsHypogammaHypoalbuminemia

肾病综合症电泳图谱

PolyclonalincreaseofIgAinbeta2andIgGingamma

肝硬化,Beta-gamma桥

原因:先天免疫缺陷,免疫抑制治疗过程中,游离轻链病)如果血清中未见异常,建议做尿本周氏蛋白检测

低免疫球蛋白血症

有症状型性免疫球蛋白疾病:

多发性骨髓瘤

巨球蛋白血症

非霍奇金淋巴瘤慢性淋巴细胞白血病重链病淀粉样病变无症状型免疫球蛋白疾病:无症状型骨髓瘤意义未明单克隆免疫球蛋白疾病（MGUS)

通过对血清蛋白电泳结果中出现的单克隆免疫球蛋白检测,对免疫球蛋白疾病进行诊断特异的白细胞

(lymphocytesB)转化为浆细胞3浆细胞

合成抗体蛋白,即免疫球蛋白.4PlasmocyteImmunoglobulin骨髓主要分化为3类细胞:

红细胞

:通过血液循环系统为人体提供氧气白细胞:参与人体免疫功能血小板:参与血凝

免疫球蛋白

在免疫系统中被用来识别和消灭如细菌或病毒等外源物52正常免疫球蛋白的合成正常浆细胞NormalProteinogram骨髓瘤或其他恶性浆细胞增生ProteinogramshowingMonoclonalpeakNormalImmunoglobulin骨髓

存在于多种骨组织(脊髓,颅骨,盆骨,肋骨)出现的单克隆M蛋白1正常免疫球蛋白的电泳结果图谱单克隆免疫球蛋白的电泳图谱多发性骨髓瘤和单克隆免疫球蛋白

人群分布:多发性骨髓瘤仅次于白血病,是目前发病率排第二位的恶性血液肿瘤占所有肿瘤的1%(每年超过15000人死于该疾病)欧洲目前有60000患者,世界范围有250000因浆细胞过度增殖,继而影响骨髓症状

出血症

骨痛,骨损伤

反复易感染

贫血

频繁出现无法解释的骨折多发性骨髓瘤易感染:当某一种Ig异常升高时，会抑制其他类型免疫去蛋白的合成

骨损伤:骨痛,骨折

肾功不全

神经症状(脊髓压迫)

贫血

血小板减少

这种疾病会持续发展，必须及早治疗，否则只能存活3-4年。及早诊断，及早治疗。

多发性骨髓瘤的并发症有症状型多发性骨髓瘤:血中或尿液中出现>30g/L的M蛋白骨髓浆细胞

>10%骨髓瘤相关的其他器官或组织损伤:血钙浓度增加

>2.75mmol/l肾损伤（肌酐浓度~或>20mg/L）贫血:Hb<100g/L骨病变（溶病变或严重骨质疏松压缩性骨折）其他症状:高血粘度、淀粉样病变、复发性细菌感染(12个月内多于2次）

骨髓瘤的诊断标准国际骨髓瘤基金会无症状型骨髓瘤血清M蛋白浓度介于

15-30g/L

骨髓浆细胞>10%

无骨髓瘤有关的器官或组织受损意义未明M蛋白疾病（MGUS）M蛋白<15g/L,相对稳定,未出现明显增加骨髓浆细胞<10%无骨髓瘤相关的组织或器官损伤没有其它B细胞淋巴组织增生性疾病或轻链相关的淀粉样变性的证据

骨髓瘤的诊断标准

国际骨髓瘤基金会MonoclonalIg(M蛋白)PolyclonalIgsPolyclonalIgs(正常免疫球蛋白)MonoclonalIg(单克隆免疫球蛋白的异常条带)

使用常规琼脂糖凝胶电泳方法检测M蛋白

(正常血清蛋白电泳图谱)

(出现M蛋白的血清蛋白电泳图谱)

使用最新的毛细管电泳方法检测M蛋白

单克隆M蛋白的电泳位置常见于Gamma球蛋白区域

少数情况下也会出现在其他区域

(Beta1,Beta2和Alpha区域)需要做血清免疫固定(IF)对M蛋白进行鉴定(尿样做本周氏蛋白检测)高浓度的M蛋白出现微量的M蛋白需要做血清免疫固定(IF)对M蛋白进行鉴定(尿样做本周氏蛋白检测)M蛋白出现在Beta1区带需要做血清免疫固定(IF)对M蛋白进行鉴定(尿样做本周氏蛋白检测)Beta2>beta区带,同时排除炎症或肝病的情况下,

建议做免疫分型或免疫固定电泳M蛋白出现在Beta2区带Alpha2>参考值,同时排除炎症的情况下,建议做免疫分型或免疫固定电泳

M蛋白出现在Alpha2?Mode‘’fromthetoptothebottom

’’Mode‘’fromvalleytovalley’’

单克隆M蛋白定量的两种方法对患者的M蛋白随访过程只能使用其中一种方法，并坚持使用对M蛋白的定量,可以判断患者治疗后的疗效M蛋白定量的意义部分缓解（PR):治疗后M蛋白峰降低50%

很好的部分缓解（VGPR):治疗后M蛋白峰降低90%

完全缓解（CR):治疗后M蛋白峰消失，免疫固定结果为阴性

特效完全缓解（sCR):治疗后M蛋白完全消失且长时间监控均为阴性)

因此,对M蛋白的定量非常重要药物疗效观察寡克隆免疫球蛋白异常:出现多个微量的M蛋白电泳条带.主要是由于免疫球蛋白的亚型的合成调控异常或受外界刺激.寡克隆免疫球蛋白异常不属于恶性疾病该异常可见于:

-自身免疫病（类风湿关节炎，干燥综合症，红斑狼疮等)

-病毒、细菌和寄生虫引起的感染-

H.I.V.-

病毒C或B型肝炎-巨细胞病毒感染

-

与移植相关的自身免疫反应或患者正处于免疫抑制治疗寡克隆免疫球蛋白寡克隆免疫球蛋白异常的电泳图谱需要做血清免疫分型（IT）或免疫固定(IF)对M蛋白进行鉴定(尿样做本周氏蛋白检测)临床实例查看电泳结果的每个区带的含量变化和异常条带出现情况

*区带含量升高 *区带含量下降 *出现异常条带或条带形状异常(某个条带变形）

其他需要参考的因素

整体上判断图谱变化查看血清的颜色和状态（溶血?凝集?浑浊?沉淀？)

总蛋白浓度患者年龄:45岁以上人群易出现M蛋白疾病其他临床信息:是否有骨痛、体重降低、贫血、血液沉降速度增加、高血钙?峰值测量和跟踪Inconclusion小结在Gamma区出现明显条带在Alpha2或Beta区带出现多余条带beta条带含量出现单一升高

如果血清蛋白电泳结果出现下列异常需要进行完整的血清蛋白免疫分型（IT）检测加样:同一样品重复加样6次

Forserumwith5g/l<[totalIg]<20g/l 1/6forGtrack,20µlofserum+100µLofdiluent(providedintothekit) 1/3forELP,A,M,KandLtracks,30µLofserum+60µLofdiluent2)电泳:高达42v.h（大约9分钟)

3)电泳结束后,加不同类型抗血清:TrackELP:fixativesolutionTrackG:antiserumantiIgGheavychainTrackA:antiserumantiIgAheavychainTrackM:antiserumantiIgMheavychainTrackK:antiserumantikappalightchainTrackL:antiserumantilambdalightchainincubationtime

4)吸出多余的抗血清,烘干胶片5)清洗胶片,染色

灵敏度：可达125mg/L，取决于多克隆的背景

用传统的免疫固定(IF)电泳方法鉴定M蛋白出现在gamma区带的IgML型M蛋白出现在gamma区带的IgG

K型M蛋白=出现在gamma区带的M蛋白IFMonoclonalIgGLambdabetweenalpha2andbetaIgGLambda型M蛋白MonoclonalIgALambdainalpha2IgALambda型M蛋白

单克隆M蛋白出现在Alpha2-Beta区带双克隆M蛋白:2组M蛋白

IgGkappa+IgAkappa型M蛋白IgMkappa+IgMlambda型M蛋白IF寡克隆免疫球蛋白电泳图谱

IgG型寡克隆电泳图谱IFIgG型寡克隆电泳图谱Inconclusion总结

应用Sebia技术进行血清蛋白电泳(SPE)和免疫分型(IT)

检测的意义可以对多种异常疾病进行诊断，如炎症,肝硬化,肾病综合症,M蛋白血症同时做SPE和IT，可以对M蛋白进行定量鉴定,可以监控M蛋白血症治疗同时做SPE和IT，可以对早期的无症状骨髓瘤和意义未明M蛋白血症进行早期检测和随访，及时掌握患者病情变化检测意义重大。用毛细管技术，成本低,完全自动化

在法国血清蛋白电泳指导原则医生开化验单如果怀疑出现骨髓瘤症状

（易疲劳,体重下降,贫血,骨痛,年龄45岁以上,血沉速度加快,总蛋白升高…)

强力推荐血清蛋白电泳做为定向检测（排查检异）在进行其它的血清蛋白检测之前，必须做血清蛋白电泳

给临床的报告单格式

报告单必须含有以下内容:

电泳条带图谱

检测结果的M蛋白峰必须给出%和g/L数值

全部图谱条带的解析

患者的随访随访可以区分患者的M蛋白血症的发病阶段

第一年每3-4个月进行一次随访如果M蛋白浓度<15g/L,且长时间稳定,定义为意义未明M蛋白血症如果M蛋白含量持续升高,根据临床症状,判断是否是无症状骨髓瘤或有症状骨髓瘤

何时推荐免疫固定(IF)电泳检测

如果患者血清蛋白电泳出现的M蛋白需要分型如果出现原因不明的丙种球蛋白偏低，患者有高骨髓瘤风险(根据年龄、性别、患病史、….)如果血清电泳结果正常，但患者有骨髓瘤、轻链沉淀病、淀粉样病变、….等疾病临床症状IMF:InternationalMyelomaFoundation(国际骨髓瘤基金会:2010版M蛋白早期筛查标准)IMF:InternationalMyelomaFoundation(国际骨髓瘤基金会:2010版M蛋白疾病早期诊断标准)尿蛋白的电泳研究肾单位的生理结构和各类生理蛋白2百万个肾单位每天过滤180升的血浆，同时产生大约1.5升的尿液。肾小管的废弃物排放最后形成的尿液含有1/3的白蛋白和2/3球蛋白肾小管重新吸收白蛋白转铁蛋白免疫球蛋白小分子蛋白肾小球过滤白蛋白转铁蛋白免疫球蛋白小分子蛋白小分子蛋白尿蛋白:定义在生理学角度讲，正常的人的尿蛋白量在50至120mg/24

h(大约在100mg/L)

主要的蛋白是白蛋白(少于30mg/L)病理上的肾功能疾病：当尿蛋白量大于150mg/24

h

而此时，尿蛋白的成分也是不定的。导致尿蛋白含量增加的原因生理上的因素:间歇性的(站立过久,正餐以后,运动过后,压力之下)肾前性:高血压,发烧,心脏或肝脏功能衰退,…

蛋白浓度升高(尿蛋白含量过高)肾性:肾小球或肾小管受到损伤(或者两个同时受到损伤)肾后性:泌尿系统出现损伤肾前性的尿蛋白尿蛋白含量增加某一种蛋白含量出现异常升高，超出了肾小管对于这一蛋白的再吸收能力。原因自由轻链,主要是在单克隆免疫球蛋白疾病中beta2微球蛋白,淋巴组织增生综合征溶菌酶,在一些急性髓细胞白血病血红蛋白,在结合珠蛋白饱和后出现的溶血现象中血清粘蛋白,又称为Alpha酸性糖蛋白，在支气管癌患者中肌红蛋白,在横纹肌出现溶解患者中上述各类情况均可导致出现肾病

(尤其是含有自由轻链的本周氏尿蛋白)>67kDa<67kDa尿蛋白含量增加肾性尿蛋白分析在HYDRAGEL5PROTEINURIE

凝胶上主要的尿蛋白的电泳条带区域分析起源于肾小管的各类蛋白(分子量<67kDa)起源于肾小球的各类蛋白(分子量>67kDa)白蛋白(分子量:67kDa)a1-微球蛋白

(MW:33kDa)游离轻链

(MW

25kDa)转铁蛋白

(MW:80kDa)Cystatin(MW:11kDda)b2-微球蛋白

(MW:12kDa)溶菌酶

(MW:15kDa)视黄醇结合蛋白(MW:21kDa)游离轻链的二聚体(MW

50kDa)IgG(MW:160kDa)IgA(MW:165kDa)结合珠蛋白加样位置a2-巨球蛋白

(MW:900kDa)注:(CystatinC),血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C肾小球过滤小分子蛋白,分子量小于67

kDa,被过滤到尿液中.其他决定各种蛋白被过滤的因素:分析形状,带电量,血浆浓度.还有一些血液动力学因素可影响蛋白的过滤.肾小球损伤经常出现于成人及儿童患者中,表现为尿蛋白含量出现增加现象

(大于1

g/24-h)原因糖尿病感染性损伤(细菌感染,乙肝患者,水痘,梅毒,单核白血球增多症

,…)其他系统性疾病(自动免疫系统,癌症,…)中毒现象(重金属,药物中毒,…)此时,我们可以在尿蛋白中发现白蛋白和其他大分子量蛋白(大于67

kDa)。临床示例肾小管的再次吸收功能在肾小球中被过滤掉的小分子蛋白，分子量小于67

kDa,将会在肾小管内被重新吸收(内吞作用).

99%的在肾小球内被过滤的蛋白,都将会被重新吸收利用.

例如,

18

g/24-h白蛋白将会被过滤掉;

30

mg/L

白蛋白在人的尿液中被发现.

肾小管损伤肾小管损伤将会改变其对小蛋白分子的重新吸收能力

(小于67

kDa的蛋白)通常是暂时性的,并且少于0.5

g/24-hours原因遗传原因(Fanconi’ssyndrome)免疫球蛋白单克隆扩增(骨髓瘤)药物作用(抗癌药物)中毒现象(重金属)白蛋白(<30%)及其它小分子蛋白(小于67

kDa)都将会在尿液中被找到.>67kDa<67kDa肾小管损伤<67kDa>67kDa>67kDa<67kDa混合性损伤临床示例肾小球、肾小管均受损伤。临床示例5PROTEINURIE14.3KDa26.6KDa150KDa66KDa轻链病多表现为肾脏损害，极易误诊为慢性肾炎。我们认为轻链有3种形式出现在血清或尿中；一是正常的轻链过剩（Kappa和Lambda同时出现），多出现于慢性肝病，红斑狼疮等多克隆增殖中。二是伴随轻链。三是单一轻链，血和尿中只出现单一增殖的大量轻链。BenceJonesprotein浆细胞增生症影响血液中出现游离轻链尿液中出现起因结果肾小管损伤淀粉样病变轻链沉淀病骨髓瘤巨球蛋白血症CLL慢性白血病MGUS.....HenryBenceJones于1844年在一个骨髓瘤患者尿中发现的一种具有特殊凝溶性质的蛋白该种蛋白40－60℃发生沉淀，加热煮沸时溶解，冷却后又沉淀。后被证明是单克隆的免疫球蛋白轻链二聚体。大多数骨髓瘤患者尿中有本周氏蛋白轻链单体（κ链）2－4小时清除，肾小球滤过率为40％；轻链二聚体（λ链）3－6小时清除，肾小球滤过率为20％；多聚体的清除速率降低；肾功能衰竭的MM患者完全清除需2-3天。正常免疫球蛋白的合成

18分钟10分钟浆细胞一条重链一条轻链组合一分子免疫球蛋白过剩轻链肾小球滤过10%在肾小管分解代谢80%重吸收10%随尿排出BJP检测方法热沉淀反应法：根据其凝溶特性设计的定性分析方法，灵敏度低。免疫固定电泳法：结合免疫沉淀技术的电泳法，特异性好。免疫化学法：免疫比浊法，可对血清游离轻链进行定量，灵敏度高。尿免疫固定电泳浆细胞病的诊断和治疗监测某些情况下，特别是对轻链型的M蛋白，比血清免疫固定电泳更加敏感。因为游离轻链的分子量比较小（25－50KDa）更容易通过肾脏清除进入尿液中，从而在尿中被检测到。下列参数会影响本周氏蛋白的毒性:等电点(pI):

-Whenthe