植物组织培养校本教材123

⑧高压锅在工作过程中，应有专人看守，如发现异常情况，应及时采取措施，以免发生安全事故。）为使培养基灭菌更加安全可靠，可采用操作方便的智能型蒸汽灭菌锅，只需按要求设定所需灭菌的时间和温度，就能自动完成整个灭菌程序。除了培养基外，外植体消毒处理所需的无菌水、玻璃器皿和接种器械也可采用高压蒸汽灭菌，但灭绝时间比培养基稍长些。3.4外植体的选择与消毒3.4.1外植体的选择外植体的概念在植物组织培养中，用来进行培养的植物材料称外植体（explant）。一般指初次接种，即在初代培养中用来接种的植物材料，包括各种植物器官、组织和细胞。将外植体经过处理后接种到培养基上是植物组织培养的第一步，这一环节被称初代培养。外植体的选择外植体的选择是进行组织培养建立无菌体系以及植株再生关键一步。尽管所有的植物细胞都具有全能性，即重新形成植株的能力，也就是植物的任何器官在理论上都可以用作外植体。但不是任何细胞都能表现出来，所以，接种时要选择那些在培养时易起反应，容易进行再分化产生植株的部位作实验材料。实际上，在同一植物的各个不同部位的组织，器官中，其形态发生的能力，可因植物的年龄、季节及生理状态而有很大不同。这会影响到繁殖效果以及成本。因此，在决定选用一个合适的培养材料时应考虑到：1）植物的种类及品种的选择：应考虑选择具有良好表型的植物，如抗逆性强、产量高、产品质量高等植株，为育种选择的外植体应选择表型最优的材料。理论上任何一种植物都能进行组织培养，实际上物种间、品种间或类型间差异很大。一般的选易于离体培养的种类、品种或类型；选生产上或研究意义比较大的种类、品种或类型。2）外植体的增殖能力：外植体必须有良好的增殖能力，并且应在培养基中继续筛选增殖能力最强的材料，同时需要考虑通过试验筛选繁殖不同基因型植物所需要的特殊培养基。3）外植体的大小选择：培养效果是一个外植体细胞总体对各种培养因子的综合反应，因此外植体的表面积、体积、细胞数量等都会影响培养效果。一般选择的外棋体大小可以在0.5～1cm。外植体太大容易污染，过小不容易启动或启动后仅仅产生愈伤组织或容易褐化死亡。在以植物脱素为培养目的时，应选用较小的外植体，一般在0.2～0.5cm。如果选择的外植体过大，则达不到脱素的目的。对于茎尖、胚、胚乳等培养，则以器官或组织为单位切离即可。4）取外植体的季节和时间：选取外植体的季节和时间，对培养材料的启动和培养至关重要。特别是进行离体培养快速繁殖时，显得尤为突出。一般处于生长季，较幼嫩的外植体培养容易。春夏季取材灭菌容易，秋冬季取材难以存活，雨季湿热季节取材不容易成功。3.4.2外植体灭菌作为植物组织培养中的外植体材料有叶、茎、器官、吸芽等，灭菌过程要求既能有效的杀死微生物，又不损失植物组织。操作步骤如下：1）将采来的植物材料去除不需要的部分。2）将外植体置于流水下冲洗数小时，必要时需在洗衣粉溶液中浸泡清洗。3）将清洗后的外植体用无菌水冲洗数次，置于70%的酒精中浸泡15-30秒。4）将浸泡过的外植体置于升汞（次氯酸钠、漂白粉）中浸泡5-10分钟，然后用无菌水清洗干净，以防止消毒剂对外植体的伤害。药用及花卉植物外植体常用消毒剂及效果，见表3-2.表3-2药用植物外植体常用消毒剂及效果消毒剂使用浓度%消毒时间min去除难易效果升汞0.1-0.25-8易最好次氯酸钠2-55-30易很好漂白粉9-105-30较难很好过氧化氢10-125-15中好硝酸银15-30中好抗生素4-50mg/L30-60中较好3.4.3外植体的接种外植体的接种是把经过表面消毒后的植物材料切割或分离出器官、组织、细胞，转移到培养基上的过程。整个接种均需在无菌条件下进行操作，一切用具、材料、培养基、接种环境等都要无菌。接种前准备接种前30min应对接种室和超净工作台消毒，操作人员也应洗手，消毒并穿上工作服。组织培养中污染的主要来源是空气中的细菌和真菌孢子，因此每次接种前均应进行地面清洁和环境消素，用70％酒精喷雾使空气中的细菌和真菌孢子，随灰尘的降落而沉降，并用紫外线灯照射20min。接种前超净工作台面要用新洁尔灭或70％的酒精擦拭。培养皿、酒精灯和其它工具也应预先放在超净工作台上，一起用紫外灯照射。由于工作人员的头发、衣服、手指都不同程度地带有杂菌，因此在接种时要穿上工作服，戴上帽子，也必须修剪指甲，并用肥皂洗手，最好在新洁尔灭溶液中浸泡10min，接种操作前则用70％酒精擦拭。工作人员呼吸也会产生污染，特别是在接种时谈话或咳嗽更易引起污染，因此，在操作时应禁止谈话并应戴上口罩。外植体接种切取外植体材料时，较大的材料用肉眼观察即可操作分离，较小的材料需要在双筒实体显微镜下放大操作。分离工具一定要预先放好，工具要锋利，切割动作要稳且快，防止挤压，以免材料受损伤而导致培养失败。材料的分割应在无菌培养皿中进行，为避免接种时发生交叉污染，通常在无菌滤纸上切取材料。刀和镊子、剪刀等接种工具在每次使用之前，均应在酒精灯火焰上反复灼烧，但应放凉后再接种，以防烫伤外植体。也可先放入70％酒精中浸泡，再在酒精灯火焰上灼烧。

外植体接种的具体操作如下：左手持培养容器（三角瓶、试管、果酱瓶等），右手轻轻取下封口纸或拧开瓶盖，将容器口靠近酒精灯火焰，瓶口略倾斜，以防空气中微生物落入瓶中造成污染，将容器口外部在火焰上灼烧数秒，以将灰尘杂质等固定在瓶口处。用灭过菌的镊子夹取切割好的外植体送入容器中并置于培养基上，这一过程要轻缓，并避免外植体材料碰到容器口和容器壁。

外植体在培养容器内要分布均匀，一方面保证培养基养分供应均匀，同时也保证出芽后小植株不会相互遮光。茎尖、茎段等外植体基部应插入培养基，但不宜过深，不能使芽陷入培养基中。叶片一般将叶背接触培养基，因为中背气孔较多，更容易吸收水分和养分。接种后，应及时封口或拧好瓶盖，以防空气中微生物落入瓶中。所有材料接好后，应做好标记，注明植物品种或品种代号、处理名称、接种日期及接种人，然后统一放入培养室培养。3.5材料的培养3.5.1培养方法1）固体培养固体培养是用琼脂固化的培养基来培养植物材料的方法。这是现在最常用的方法。该方法设备简单，易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐变中毒现象发生。2)液体培养液体培养是用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。如细胞悬浮培养、原生质体培养等。液体培养需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，常采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。3.5.2培养条件接种后的外植体应转移到培养室进行培养，培养条件要根据植物对环境条件的不同需求进行调控。培养室控制的条件主要有温度、光照、湿度和气体。1）温度温度是植物组织培养中的重要因素，在适宜的温度下植物才能良好地生长、分化。多数植物适宜生长温度为20-30℃，低于15℃时生长停止，高于35℃时会抑制正常生长和发育。2）光照光是植物进行光合作用必不可少的条件之一，对离体培养物的生长发育具有重要的作用。光照的影响主要表现在光照强度、光照时间和光质三个方面：（1）光照强度对大多数植物来说，1000-4000lx的光强就能满足其生长的需要。器官的分化需要光照，并随着试管苗的生长光照强度需要不断的加强，才能使小苗生长健壮，并促进它从“异养”向“自养”转化，以提高移栽后的成活率。而对愈伤组织的诱导来说，暗培养比光培养更合适，所以在前期可以适当的对光照进行控制，以提高分化生长。（2）光照时间普通培养室要求每日光照12-16h，生产中，在不影响材料正常生长的情况下，尽量缩短光照时间，以减少能源消耗，降低生产成本。（3）光质光质对细胞分裂和器官分化有很大的影响，但目前尚无规律可循，可根据植物在生长中的具体现象加以调整和改善，以达到节约能源，提高产量的目的。3）湿度组织培养中湿度的影响主要有培养容器内湿度和培养环境湿度两方面。（1）培养容器内湿度容器内湿度通常可保持在100%，之后随着时间的推移，相对湿度也会相应下降，容器内的湿度主要受琼脂含量和封口材料的影响，在冬季应适当减少琼脂用量，否则培养基干硬，不利于外植体接触或插进培养基中，导致生长发育受阻。（2）培养室环境的湿度环境湿度变化随季节和大气而有很大的变动。湿度过高或过低对植物材料的生长都不利，过低会造成培养基失水干枯，影响培养物的分化合生在；过高会造成杂菌滋生，导致污染。通常培养室的湿度要保持在70%-80%。4）气体环境植物组织培养中，植物的呼吸需要氧气。在液体培养基中，需进行振荡和旋转以解决氧气供应。在固体培养基中，接种时不要把培养物全部埋入培养基中，以避免氧气不足。另外切割外植体后产生的乙烯和培养物产生的二氧化碳也会阻碍培养物的生长和分化。因此培养室要定期进行通风换气，每次通风后要进行消毒以防止污染。3.5.3初代培养初代培养是指接种外植体后最初的几代培养，其目的是获得无菌此材料和无性繁殖系。初代培养建立的无性繁殖系包括茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。1）培养基的选择初代培养基时常采用诱导或分化培养基，培养基中的生长素和细胞分裂素的配比和浓度最为重要，诱导不定芽时需要较高的细胞分裂素；诱导愈伤组织形成时，增加生长素的浓度并补充一定的细胞分裂素是十分必要的。2）外植体的生长和分化（1）顶芽和腋芽发育这种发育方式的特点是不经过逾伤组织阶段而直接再生繁殖。发育方式：茎尖、侧芽、节等外植体→直接再生丛生芽→幼茎→生根→小植株（2）不定芽发育：经过逾伤组织阶段诱导产生小植株由不定芽产生的组织培养苗，比直接从顶芽或腋芽中产生的丛生芽苗，具有更大的性状变异几率。发育方式：根、茎、叶等外植体→逾伤组织→生长点→幼茎→生根→小植株（3）胚状体发育：由植物的体细胞，经过诱导产生的体细胞胚，其功能类似合子胚，但与合子胚不同。优点是成苗数量多，速度快，结构完整。（4）原球茎发育：由茎尖或侧芽的培养中产生原球茎并增殖、萌发出小植株。石斛属的植物是常见的原球茎发育植物，其种子、茎段、茎尖、叶片、幼根都可以作为外植体诱导原球茎产生，但外植体的选取部位对诱导会产生一定的影响，如铁皮石斛，基部茎段的增殖系数比上部茎段的增殖系数高，生长速度快。3.5.4继代培养继代培养的目的植物在培养过程中，如长期在同一培养基上培养，会出现以下情况：1）培养基中成分不断被消耗，无法满足继续生长的需要；2）试管苗生长旺盛，容器大小开始限制植物生长；3）培养过程中植物材料所分泌的有毒有害物质，积累过多对植物组织产生伤害。4）长期不转接会产生污染。因此，当容器中植物材料持续培养一段时间后，必须转接进行继代培养。继代培养又称增殖培养是指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上。继代培养可采用无菌苗进行继代，也可利用逾伤组织进行继代培养。继代培养的方法继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁殖培养过程。旨在繁殖出相当数量的无根苗，最后能达到边繁殖边生根的目的。继代培养的后代是按几何级数增加的过程。如果以2株苗为基础，那么经10代将生成210株苗。

继代培养中扩繁的方法包括：切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离原球茎等。1）切割茎段常用于有伸长的茎梢、茎节较明显的培养物。这种方法简便易行，能保持母种特性。培养基常是MS基本培养基；2）分离芽丛适于由愈伤组织生出的芽丛。培养基常是分化培养基。若芽丛的芽较小。可先切成芽丛小块，放入MS培养基中，待到稍大时，再分离开来继续培养。3）分离原球茎将原球茎切割成小块，也可以给予针刺等损伤，或在液体培养基中振荡培养，来加快其增殖进程。4）胚状体增殖

增殖使用的培养基对于一种植物来说每次几乎完全相同，由于培养物在接近最良好的环境条件，营养供应和激素调控下，排除了其他生物的竞争，所以能够按几何级数增殖。

在快速繁殖中初代培养只是一个必经的过程，而继代培养则是经常性不停的进行过程。但在达到相当数量之后，则应考虑使其中一部分转入生根阶段。从某种意义上讲，增殖只是储备母株，而生根才是增殖材料的分流，生产出成品。继代培养的影响因素（1）植物材料不同种类的植物，同种植物不同品种，同一植物不同器官和不同部位，继代纺织能力也各不相同。一般是草本>木本；被子植物>裸子植物；年幼材料>老年材料；刚分离组织>已继代的组织；胚>营养组织；芽>胚状体>愈伤组织。在以腋芽或不定芽增殖继代的植物中，在培养许多代之后仍然保持着旺盛的增殖能力，一般较少出现再生能力丧失。（2）培养基在规模化生产中，培养的植物品种一般比较多，而且来源也比较复杂，品种间的差异表现非常明显。在培养基的配制和使用上，一定要多样化，否则会造成一些品种因为生长调节剂过高或过低而严重影响繁殖和生长。另外，在同一品种上，适当调整培养基中生长调节剂的浓度也是非常重要的，其目的的主要是为了保证种苗的质量，同时又可以维持一定的繁殖基数。一些植物经长期继代培养，在开始继代培养中需要加入生长调节剂，经过几次继代后，加入少量或不加生长调节剂也可以生长。如在胡萝卜搏壁组织初代培养中加入10-6mol/LIAA才能达到最大生长量，但在继代培养10代以后，不加IAA的培养基上也可达到同样生长量。在兰科植物原球茎继代培养中情况也相同。（3）培养条件培养温度应大致与该植物原产地生长所需的最适温度相似。喜欢冷凉的植物，以20℃左右较好，热带作物需在30℃左右的条件下才能获得较好的生长。如香石竹在18-25℃随温度降低生长速度减慢，但苗的质量显著提高，玻璃化现象减少，高于25℃时，引起苗徒长细弱，玻璃化或半玻璃化苗明显增加。另在桉树继代培养中发现，如果总在23-25℃条件下培养，芽就会逐渐死亡，但如果每次继代培养时，先在15℃下培养3d，再转至25℃下培养，生长良好。（4）继代周期对一些生长速度快或者繁殖系数高的种类如满天星、非洲紫罗兰等，继代时间比较短，一般不超过15d。对生长速度比较慢的种类如非洲菊、红掌等，继代时间就要长一些；30-40d继代1次。继代时间也不是一成不变的，要根据培养目的、环境条件及所使用的培养基配方进行考虑。在前期扩繁阶段，为了加快繁殖速度，当苗刚分化时就切割继代，而无需待苗长到很大时才进行继代。后期在保持一定繁殖基数的前提下，进行定量生产时，为了有更多的大苗可以用来生根，可以间隔较长的时间继代，达到既可以维持一定的繁殖量，又可以提高组培苗质量的目的。（5）继代次数继代次数对繁殖率的影响因培养材料而异。有些植物如葡萄、黑穗醋栗、月季和倒挂金钟等，长期继代可保持原来的再生能力和增殖率。有些植物则随继代次数而增加变异频率，如继代5次的香蕉不定芽变异频率为2.14%，继代10次后为4.2%，因此香蕉组培苗继代培养不能超过1年。还有一些植物长期继代培养，会逐渐衰退，丧失形态发生能力。具体表现为生长不良，再生能力和增殖率下降等。3.5.4生根培养在试管苗增殖到一定数量后，就要使部分苗分流进入壮苗与生根阶段。若不能将培养物大量转移到生根培养基上，一方面就会使久不转移的苗子发黄老化，或因过分拥挤而致使无效苗增多，最后被迫淘汰许多材料；另一方面，试管苗是在无菌、有营养供给、适宜光照、温度和几乎100%相对湿度的环境中生长的，一旦出瓶，移栽环境发生了剧烈的变化而不利于其生长；同时由于试管苗幼嫩，环境中的杂菌极易侵染，导致试管苗死亡。为了适应移栽后的较低的湿度以及较高的光强，完成试管苗从“异养”到“自养”的转变，需要有一个适应过程。壮苗培养在继代培养过程中，细胞分裂素浓度的增加有助于增殖系数的提高。但伴随着增殖系数的提高，增殖的芽往往出现生长势减弱，不定芽短小、细弱，无法进行生根培养的现象；即使能够生根，移栽成活率也不高，必须经过壮苗培养。壮苗培养时，可将生长较好的芽分成单株培养，而将一些尚未成型的芽分成几个芽丛培养。通过选择适宜的细胞分裂素和生长素的种类及不同浓度配比，可以同时满足增殖和壮苗的不同要求。如在杜鹃快繁的研究中发现，ZT/IAA或ZT/IBA的比值升高，芽的繁殖系数也随之增加，但壮苗效果却降低。高浓度的生长素和低浓度的细胞分裂素的组合有利于形成壮苗。因此，在以丛生芽方式进行增殖时，适当降低培养基中BA等细胞分裂素的浓度，并增加NAA等生长素的浓度，就能达到壮苗培养的目的。在实际生产中，我们一般用较低浓度的细胞分裂素与生长素组成合理的比列，将有效增殖系数控制在3.0-5.0，以实现增殖和壮苗的双重目的。生根培养（1）试管内生根试管内生根是将成丛的试管苗分离成单苗，转接到生根培养基上，在培养容器内诱导生根的方法。试管苗生根的优劣主要体现在根系质量（粗度、长度）和根系数量（条数）吸收方面。不仅要求不定根比较粗壮，更重要的是要有较多的毛细根，以扩大根系的吸收面积，增强根系的吸收能力，提高移栽成活率。根系的长度不宜太长，在粗而少与细而多之间，可能以后者较好。在生根阶段对培养基成分和培养条件可进行调整，减少试管苗对异养条件的依赖，逐步增强光合作用的能力。对于大多数物种来说，诱导生根需要有适当的生长素，其中最常用的是NAA和IBA，浓度一般为0.1-10.0mg/L。但唐菖蒲、水仙和草莓等组培苗很容易在无生长素的培养基上生根。一般情况下矿质元素浓度较高时有利于茎、叶生长，较低时有利于生根。生根培养基中无机盐和蔗糖浓度减少一半，光照强度由原来的500-1000lx提高到1000-5000lx，能刺激小植株自身进行光合作用制造有机物，以便由异养型向自养型过渡。在这种条件下，植物能较好的生根，对水分胁迫和疾病的抗性也会有所增强，植株可能表现出生长迟缓和较轻微的失绿，但生产实践证明，这样的幼苗，要比在低光强条件下的较绿较高的幼苗移栽成活率高。生根阶段采用自然光照比灯光照明所形成的试管苗更能适应外界环境条件。培养基中添加活性炭有利于提高生根苗质量。在樱花生根培养基中加入0.1%-0.2%活性炭后，试管苗不仅生长健壮，无愈伤组织，而且根系较长、白色、有韧性，移栽后新根发生快，质量好，成活率高。（2）试管外生根有些植物种类在试管中难以生根，或有根但与茎的维管束不相通，或根与茎联系差，或有根而无根毛，或吸收功能极弱，移栽后不宜成活，这就需要采用试管外生根法。试管外生根是将已经完成壮苗培养的小苗，用一定浓度生长素或生根粉浸蘸处理，然后栽入疏松透气的基质中。大花蕙兰、非洲菊、苹果、猕猴桃、葡萄和毛白杨等均有试管外生根成功的报道。试管外生根也是一种降低生产成本的有效措施，不仅可以减少无菌操作的工时消耗，而且减少了培养基制备材料与能源消耗。生根方法1）适当延长在增殖培养基中的培养时间，直至根系长出并达到一定长度。2）采用专门的生根培养基进行培养，一般为1/2或1/4的基础培养基。3）增大NAA或IAA等生长素的浓度来促进生根。4）切割健壮的试管苗在适宜的基质中进行扦插生根。5）控制初始的培养基中生长调节剂浓度，一次性获得生根试管苗（只适用于个别植物）。3.5.4炼苗和移栽移栽前将装有健壮试管苗的培养瓶，从培养室中移到室外锻炼1-2天后，把瓶子打开，用镊子取出，清水洗去根部的培养基，转入适宜的基质中。3.3.4移栽和管理经过炼苗后，可以将试管苗移到先保湿后敞开的空间中去，移栽方式有大田移栽和容器移栽。大田移栽是对于一些木本药用植物，炼苗后先经过容器移栽，然后转移到大田中。容器移栽时将驯化的试管苗移栽到穴盘等育苗容器中。具体方法：从瓶中取出试管苗，在20℃注意事项：①从瓶中取苗时，手要轻，不能用力过猛，防止扯断苗根。②试管苗清洗时，一只手轻轻捏住苗的根茎上部，另一只手轻揉苗根，将附于其上的琼脂块和松散的愈伤组织清理掉；如果根过长，可以用锋利的剪刀剪掉一段，蘸生长素（50mg/L的吲哚丁酸或萘乙酸）或生根粉后移入苗盘。清洗一定要干净，否则残留的培养基会导致霉菌污染。③移栽基质以疏松、排水性和透气性良好都为宜，最好使用理化性状良好的复合基质。但应当注意基质的彻底消毒。④已经植入育苗盘的试管苗，应在清洁又能控温的条件下生长，空气湿度要大，如果光照强度过大应该进行适当遮荫。⑤植苗入盘的时间，最好选在无风阴湿的天气，对于一些移栽成活率低的植物，移栽时的空气湿度和光照条件是重要的影响因子。⑥移栽时先在营养钵或穴盘中装入基质至1/4处，左手轻拿试管苗，右手将苗根均匀地分布于营养钵中。移栽约1周后，应该进行适量的叶面追肥，最好使用1/4或1/2MS培养基大量元素的混合游，可以是按一定比例配制的稀磷酸二氢钾和尿素溶液。第四章实训项目实训一组培室设备参观及器皿的洗涤和灭菌一、目的要求：1．通过参观，了解组织培养室的几个主要组成部分和各部分应有的基本设备以及有关仪器的用途与功能。2．通过实际操作，学会洗涤剂的配制和各种器皿的清洗和灭菌方法。二、实验内容了解组培室的结构及主要设备的用途和性能是十分必要的，总体上的了解有利于以后各实验的进行以及正确的使用各种仪器和设备。植物组织培养是一项十分细致的工作，为了保证植物外植体不受污染，第一关就是要对各种器皿进行清洗和消毒，使它们保持无菌状态，做这些工作同样有一套科学的方法和需要熟练的技巧，因此每个学生必须学好这套基本功。三、实验原理实验仪器的清洗、消毒和灭菌是组织培养成功的关键所在，是外植体免受污染的前提。由于灭菌剂的种类不同，所以选择消毒剂既要考虑良好的消毒、杀菌作用，同时易被蒸馏水冲洗掉。四、实验仪器与材料：高压灭菌锅、烘箱、超净工作台、酸度计、空调机、万分之一天平、电炉、玻璃器皿（试管、三角瓶、移液管、漏斗、烧杯、容量瓶、试剂瓶、量筒酒精灯），以及镊子、解剖刀、解剖针、手术剪，肥皂、洗衣粉、重铬酸钾、浓硫酸等。五、方法和步骤：首先在老师带领下参观组培室，并听取讲解，然后配制洗液，称取工业用重铬酸钾40克，溶解在500ml在水中，然后徐徐加入450ml粗制浓硫酸（或废硫酸）配好的溶液呈红色，铬酸洗液是一种强氧化剂，去污能力强，但玻璃器皿上沾有油脂、凡士林、石蜡等则用此液无效，铬酸洗液可反复使用，直到溶液呈青褐色为止。此溶液腐蚀性强，洗涤时需注意。每人清洗部分玻璃器皿，方法：清水洗净→泡入洗衣粉水溶液中进行洗刷→清水反复冲洗→蒸馏水淋一遍→烘干备用。然后清洗部分较脏的玻璃器皿，方法：采用先碱后酸，即用洗衣粉洗刷后冲洗干净→晾干→侵入酪酸洗液，浸泡时间视器皿的肮脏程度而定→清水反复冲洗干净→蒸馏水淋洗一遍→烘干备用。带有石蜡或胶布的器皿：先将其除去，再用常规洗涤，石蜡用水煮沸数次即可去掉，胶布粘着物则需用洗衣粉液煮沸数小时，再用水冲洗，凉干后浸入洗液，以后的步骤同前。对器皿和用具进行高压灭菌，使用高压灭菌锅，在121℃六、考核原则按学生分组情况，观察各分组的操作情况以及完成情况。实训二

母液的制备及培养基的配制、灭菌一、

目的要求：通过掌握培养基对母液制备及常用培养基的配制和灭菌方法，为植物组织培养准备合适的营养条件。二、

实验内容学习母液和培养基的配制，灭菌的方法。三、

实验原理植物材料培养要获得成功，并正常生长，培养基的组成成分是一个决定性因素，不同植物要求不同的培养基，因此，在进行大量工作之前，对不同培养基应进行分析、比较、试验，选择一个符合试验材料需要的适宜培养基。大多数植物组织培养所用的培养基由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等五类物质组成。四、

实验仪器与材料高压灭菌锅、冰箱、普通及精密天平、电炉、玻璃器皿（烧杯、容量瓶、移液管、试剂瓶、三角瓶、漏斗），化学试剂(CaCl2·2H2O，KNO3，MgSO4·7H2O，NH4NO3，KH2PO4，Na2—EDTA，FeSO4·7H2O，MgSO4·4H2O，ZnSO4·7H2O，H3BO3，KI，NaMoO4·2H2O，CuSO4·5H2O，CoCl2·6H2O，甘氨酸，盐酸硫胺素，盐酸吡哆醇，烟酸，肌醇，蔗糖，琼脂，若干种生长调节物质及天然复合物，HCL,NaOH,酒精)，以及称量纸、药匙、玻璃棒、精密度纸，瓶盖用纸，线绳或橡皮筋、铅笔、标签纸。五、

方法和步骤1、母液的配制母液的配制是按所使用药品的类别，而分别配成大量元素、微量元素、维生素和铁盐等。配制母液时特别要注意无机盐成分在一起，可能产生的化学反应，如Ca2+和SO2-4,Ca2+,Mg2+和PO3-4一起溶解后，会产生硫酸钙或磷酸钙的不溶物沉淀，因此不能配在一起作母液贮存，应分别配制和保存。配制母液时要用双重蒸馏水等纯度较高的水，药品应采用化学纯或分析纯级，药品的称量及定容都要准确，各种药品先以少量蒸馏水使其充分溶解，然后按培养基上的排列顺序混合。现以MS培养基为例叙述如下：根据各种药品的特点，母液可配成4种。母液Ⅰ：把大量元素按培养基配方的20倍浓度混合在一起。KNO3

38克NH4NO3

33克MgSO4/7H2O

7.4克KH2PO4

3.4克CaCl2/2H2O

8.8克加水定容至1000毫升，配1升培养基时，吸收50毫升，注意CaCl2应待其它度剂彻底溶解后再加入，否则易出现沉淀。母液Ⅱ：把硼、锌、锰、铜、钴、钼等微量元素，接培养基配方浓度的1000倍浓缩配制在一起。

MnSO4*4H2O

22.3g

ZnSO4*7H2O

8.6g

H3BO3

6.2g

KI

0.83g

Na2MoO4*2H2O

0.25g

CuSO4*5H2O

0.025g

CoCL2*6H2O

0.025g加水定容至1000毫升，配一升培养基时，吸取1ml.母液Ⅲ：按培养基配方浓度的100倍液浓缩配制在一起。甘氨酸

0.20g盐酸硫胺素

0.04g盐酸吡哆素

0.05g烟酸

0.05g肌醇

10.0g加水定容至1000毫升，配一升培养基时，吸取10ml.为了配制不同培养基时使用方便，也可以将母液Ⅳ各维生素物质分别配制，一般配成浓度为：甘氨酸2mg/ml，盐酸硫胺素1mg/ml，盐酸吡哆素1mg/ml，烟酸1mg/ml，肌醇20mg/ml.母液Ⅳ：

Na2-EDTA

3.73g

FeSO4/7H2O

2.78g加水定容至500ml，配一升培养基时，吸取10ml.2．植物激素的配制：一般将植物激素配制成0.1~0.5mg/ml的溶液，由于多数植物激素难溶于水，可采用以下方法配制：6-BA、IAA、IBA:先溶于少量95%乙醇中，再加水定容。NAA:可溶于热水中或用少量95%乙醇或少量1N的NOH溶解后，再加水定容。2，4-D不溶于水，可用95%的乙醇溶解后，再加水定容。以上配好的母液需贮存于2~4摄氏度的冰箱中，定期检查有无沉淀或微生物的污染，如出现霉菌，浑浊或沉淀，则不可再用。3．培养基的配制：以配制1000ml为例，按每升培养基要求含量/每ml母液含量=母液吸取量公式，分别吸取母液1、母液Ⅱ、母液Ⅲ、母液Ⅳ各50ml、1ml、10ml、10ml及一定量的各种植物激素混合后，再加3%蔗糖及预先以一定量蒸馏水加热熔化的琼脂，然后加蒸馏水定容至于1000ml，最后用NaOH调节PH至要求值（5.4~6.0之间的一特定值），然后分装入瓶，以100ml,三角瓶为例，每瓶装培养基40ml，共装25瓶，然后盖上盖瓶（4层），扎紧后灭菌。4．培养基灭菌培养基灭菌一般采用湿热灭菌法，即将分装好的培养基放在高压灭菌锅中，加热，待压力上升到0.5kg/cm2时，打开放气阀排净冷空气，关闭放气阀继续加热使压力稳定在1.1~1.2kg/cm2，温度为121摄氏度的条件下，维持15~20分钟，培养基灭菌时间不宜过长，以防引起培养基成分的变化，灭菌后的培养基置于室温下贮存（最适宜的温度为10摄氏度），一般培养基在灭菌后二星期内应用。六、考核按分组情况，观察各分组的培养基配制情况，澄清度、配制的准确性、操作标准、灭菌效果以及实训完成后的整理。实训三植物组织培养整体方案设计操作一、目的要求通过前面项目的学习，通过查阅资料，选择合适的植物材料进行植物组织培养方案设计，要求方案设计合理，可操作性强。二、实训内容1、选择合适的植物材料2、根据选择的材料查阅相关资料3、根据所查阅资料的情况选择合适的培养基配方4、以组为单位进行方案的整体设计三、具体要求1、选择的植物材料简单常见、后续可操作性强2、要有完整的（包括植物培养的各个阶段）培养基和生长调节剂配方3、各组所选择的植物材料将作为后续项目操作的内容4、要有合理的方案设计报告实训四常见花卉植物的初代培养一、目的要求：1、掌握植物组织培养培养基的配制、灭菌和配方的选择2、掌握植物材料的消毒和灭菌处理方法3、掌握组织培养的无菌操作技术4、学会正交试验方法二、材料用具:1、带腋芽的植物茎段或叶片、茎尖等2、超净工作台、剪刀、镊子、解剖针、解剖刀、广口瓶、烧杯、培养皿、酒精灯、升汞、次氯酸钠、酒精、无菌水、培养基、记号笔、纱布、酒精棉球、等材料。3、基础培养基、生长调节剂(根据不同植物材料选择)、无菌水、70%的酒精、0.2%的次氯酸钠、0.1%的升汞三、方法步骤1、培养基配制按照配方配制好培养基并及时灭菌备用；2、取材、选材选择优良健壮五病虫害的植物植株，选取饱满的植物材料，用自来水冲洗干净，在洗衣粉水中浸泡30min,然后用流水冲洗干净；3、消毒在超净工作台上用70%的酒精消毒20-30s，无菌水冲洗一次，在0.2%的次氯酸钠中浸泡5-10min，用无菌水冲洗4-5次。4、接种根据所选择的植物材料，按照无菌操作的要求，将植物材料接种到诱导培养基上。5、培养选择合适的培养温度24°，合理的光照强度，定期观察生长情况。四、实训报告每隔七天观察一次试管苗的生长情况，并做好记录（包括污染率、萌发时间、苗高、增殖系数、正交试验的对比情况等）并写出实训报告萌发率=萌发的材料数/总接种的材料数*100%繁殖系数=每瓶形成的有效苗数/接种苗数*100%实训五试管苗的继代培养与转接目的要求：熟练掌握培养基的制作过程，掌握试管苗的茎段转接过程。

二、仪器及试剂：超净工作台及配套接种用具(无菌接种工具、酒精灯、酒精

棉球、70%酒精瓶，无菌培养皿、打火机等)

三、试验材料：取培养的试管苗。选择长势好，高度达5cm以上的茎梢种苗或芽丛种苗。每个超净台配给2瓶种苗。空白培养基：准备事先做好的10瓶空白培养基。

四、操作步骤1、配制继代培养培养基并做好灭菌备用2.接种前4小时对接种室进行熏蒸，每个超净台取10ml左右甲醛液装入

瓶中，在超净台边加入5克左右高锰酸钾，立即放入超净台里；接种前20-30分钟接通电源，打开紫外灯和风机。

3．洗净双手，穿好专用实验服进入接种室，用酒精棉球擦试双手，台面及

接种工具等。

4．将酒精灯放在距超净台边缘约30cm，正对胸前处，注意以后的操作都要

在酒精灯的10cm半径范围内完成。点燃酒精灯，对剪子和镊子过火，先从头至尾过火，然后对尖端反复过火；将种苗瓶放在灯前偏左处；将空白培养基瓶放在灯前偏右处；将接种用培养皿放在距超净台边缘约15cm，正对胸前处，以利操作的方便进行。

5．打开原种瓶，对瓶口先外壁，后内壁过火。然后准备接种：先将种苗移到

培养皿里。对香石竹等茎梢可切割茎段，剪时要茎节上部少留，节下部多留。对草莓等没有茎、只有基生叶的种苗分离芽丛，最后均分离为1-2个芽，最好为1个芽。

每瓶接4—5个茎段或小芽，若放4株呈正方形分布。若放5株最后一株要放在正方形对角线交点处。接好后，瓶口和封口膜均要过火，扎口。每接完一瓶，

接种工具要放回酒精消毒瓶。

如果技能熟练的话，可用悬接法，用镊子夹住试管苗的顶端一节，拔出瓶口，

剪断这一节，将茎段插入空白培养基中。对芽丛可提起一个芽丛的一个芽，用剪刀剪去其它部分，将单芽插入培养基里。

6.接完一瓶原种后，可用酒精棉球擦拭双手，弃去含废弃物的培养皿，换用新的无菌培养皿，以防交叉感染。

7.接完10瓶种苗后，写好标签，移出超净台，置于塑料筐里，再接下一批。

8.接种完毕，熄灭酒精灯，盖上酒精瓶，收拾净超净台面，先把种苗瓶移出，

然后将废物皿、空原种瓶、培养皿、接种工具等移出放到塑料筐里，带出接种室，清洗干净。

9.接后的培养物转移到培养室进行培养。3天后，经常检查污染情况，及时清除培养瓶。五、实训报告观察并记录转接后植物的生长情况、污染率等。实训六植物的生根培养一、实训目的

熟练掌握生根培养的各个技术环节，包括生根试管的接种，培养观察与对策等。二、实训材料转接后试管苗、空白生根培养基：准备事先做好的10瓶空白培养基。三、试验仪器试剂超净工作台及配套接种用具(无菌接种工具、酒精灯、酒精

棉球、70%酒精瓶，无菌培养皿、打火机等)。

四、实训内容及步骤

1.生根培养基的制作

2.生根试管苗的接种和培养。3、实训步骤

生根培养基基配制时可配制1/2MS，另加NAA1－2，不要加入细胞分裂素类生

长调节物质。打开种苗瓶，对瓶口先外壁，后内壁过火。然后准备接种：先将种苗移到培养皿里。对植物材料等茎梢可切割茎段，剪时要茎节上部少留，节下部多留。每瓶可接4—5个茎段或小芽，接好后，瓶口和封口膜均要过火，扎口。每接完一瓶，接种工具要放回酒精消毒瓶。

培养时，注意观察生根情况，约20天后开始分化生根，以出现长度在1cm、洁白均匀整齐的不定根为佳。不要使根发生徒长现象。五、思考和作业

1．生根培养基和其它培养基有什么区别？

2．生出的不定根以什么标准较好？实训七

药用植物铁皮石斛的组织培养一、目的要求：练习铁皮石斛茎尖外植体的剥离、灭菌和接种等无菌的操作方法，熟悉铁皮石斛快速繁殖和获得无病毒植株的全过程。二、实验内容学习和掌握铁皮石斛茎尖剥离、灭菌和接种等基本操作。三、实验原理植物茎尖处于比较幼嫩的部位，其细胞具有旺盛的生命力，易于培养而获得成功。茎尖培养根据其目的不同，取材的大小有较大的差异，较小的仅为十至几十微米的茎尖分生组织，较大的可利用几十毫米的茎尖甚至更大的芽，但一般讲茎尖愈小（小到50——100微米的生长点）培养难度就越大，有的需要一年或更长的时间才能成苗，茎尖越大培养越易获得成功。如果进行植物快速繁殖，则采用较大的茎尖，以带有叶原基的生长为宜，这样既能提高成活率，又能加快繁殖速度，如以脱毒为目的，则采用较小的茎尖，因为病毒在植株上的分布是不均匀，一般幼嫩的组织器官中病毒含量极低，以生长点含病毒最少，甚至不含病毒，所以进行脱毒种苗培养，应尽量采用极小的茎尖生长点进行培养，以获得脱毒苗。四、实验仪器与材料超净工作台、剪刀、镊子、解剖针、解剖刀、广口瓶、烧杯、培养皿、酒精灯、升汞、次氯酸钠、酒精、无菌水、培养基、记号笔、纱布、酒精棉球、铁皮石斛外植体等材料。五、方法和步骤1、选择品种性状典型的，生长健壮无病虫的铁皮石斛植株，取其已萌动的顶芽或腋芽，或剪下3~5cm生长的茎顶端，剥去大叶片，先在流水中冲流2~3小时，吸干水分，再在70%乙醇中浸半分钟，然后放入2%的次氯酸钠溶液中灭菌5分钟，用无菌水冲洗3~5次。2、在超净工作台上把灭菌的茎尖放在双筒解剖镜下剥去较小的叶片，根据不同目的，可取只带2~3个叶原基的生长点甚至不带叶原基的生长点，或带2~3片幼叶的茎尖。生长点剥离方法：在解剖镜下，一手用镊子夹住无菌的茎尖，一手用较细的解剖针剥掉生长点外围的叶片，直至达到晶莹发亮的光滑顶为止，然后用解剖刀仔细切取所需茎尖，随即接种在预先配制好的培养基上。3、培养基：茎尖分化培养基：MS+BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+3%蔗糖茎尖培养对培养容器无特殊要求，一般以15cm×20cm的试管，或50ml三角瓶为宜，每支试管装10ml培养基，每只三角瓶装25ml培养基，每管或每瓶接种一个茎尖。4、培养：接种的茎尖置于培养室内培养，温度25摄氏度±2摄氏度，光照2000Lux,以日光灯为光源，每天照光10小时。六、任务及分析1、每人接种茎尖4个，要求二个剥至带2～3个叶原基的生长点。2、定时观察记录：幼苗分化和生根情况。3、试述利用茎尖培养为什么能够脱除病毒。实训八

药用植物的花药培养一、目的要求学习药用植物花药的采集、灭菌、接种、培养等一整套花药培养的具体方法。二、实验内容以药用植物的花药为外植体，掌握对花药的灭菌、接种、培养等的方法。三、实验原理花药培养是植物育种的一种有效方法，即用离体花药培养的方法，使其中的花粉发育成一个完整的植株，这种花粉植株的染色体数目为体细胞的一半，称为单倍体植物。通过这一途径获得单倍体后再使之加倍，就能得到纯合二倍体，从而为准确研究性状遗传规律和杂种优势的利用打下基础。四、实验仪器与材料不同药用植物的花药，纱布、塑料袋、三角瓶、70%酒精、冰箱、显微镜、醋酸洋红、载玻片、盖玻片、MS培养基的各种化学药品。各种灭菌、接种、培养用具和器皿等。五、方法和步骤1、镜检确定花粉发育期：本实验在培养前先采集处于适宜时期的花蕾利用醋酸洋红压片法进行镜检，选取适宜的花粉发育时期。2、预处理：采集花蕾，用湿纱布包好放入塑料袋，置于3~5摄氏度冰箱中处理7天左右。3、培养基准备采用MS培养基+2，4-D0.4mg/L+KIN0.2mg/L+IAA4mg/L+蔗糖3~8%。4、花药灭菌及接种：接种前花蕾经0.1%升汞灭菌10~15分钟，然后用无菌水冲洗3~5次，在无菌条件下取出花药进行接种，注意不要破坏花药，每瓶接种20~30个花药。5、诱导培养：将培养瓶置于温度25~30%，光强1500~2000Lux,每天光照相馆0小时的培养室中，诱导形成体胚或愈伤组织。6、分化