SC-T 7028-2022 水产养殖动物细菌耐药性调查规范 通则

ＩＣＳ

CCS

B

50备案号：XXXX-XXXX中华人民共和国水产行业标准SC／Ｔ

7028—2022

2022－

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2023－

03－

01

中华人民共和国农业农村部发布SC/T

７０２８—２０２２前言本文件按照

GB/T１１—２０２０«标准化工作导则第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出.S本文件由全国水产标准化技术委员会(AC/TC１５６)归口.S本文件起草单位:全国水产技术推广总站、中国水产科学研究院珠江水产研究所.本文件主要起草人:刘忠松、邓玉婷、陈艳、陈学洲、姜兰、冯东岳、宋晨光.ⅠSC/T

７０２８—２０２２水产养殖动物细菌耐药性调查规范范围本文件界定了水产养殖动物细菌耐药性调查规范的术语和定义,确立了水产养殖动物细菌耐药性调查流程,规定了细菌耐药性调查中样品采集、信息采集、细菌分离鉴定、菌株保存、药物敏感性试验、结果判定和结果记录与统计的要求,描述了上述各步骤相应追溯或证实的方法.本文件适用于水产养殖动物细菌对渔用抗菌药物的耐药性调查.规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.分析实验室用水规格和试验方法水生动物病原菌实验室保存规范术语和定义下列术语和定义适用于本文件.３１３２３３３４３５３６

ei采样点samplei同一水域、同一品种、相同环境及养殖条件的养殖场为一个采样点.t i最小抑菌浓度minimalinhibioryconcentatont i在采用稀释法测定药物敏感性的试验中,能抑制细菌生长的最低抗菌药物浓度.折点breakpointi

e用于区分菌株为敏感、中介和耐药的

MICi

e敏感susceptble抗菌药物对菌株的

MIC值等于或低于敏感折点,即菌株对该药物表现为敏感.e中介intrmediatit抗菌药物对菌株的

MIC值在高于敏感折点且低于耐药折点的范围内,即菌株对该药物表现为中介it耐药ressant抗菌药物对菌株的

MIC值等于或高于耐药折点,即菌株对该药物表现为耐药.耐药性调查流程细菌耐药性调查按以下流程进行:a)样品采集;b)信息采集;c)细菌分离鉴定;１SC/T

７０２８—２０２２d)菌株保存;e)药物敏感性试验(微量肉汤稀释法);f)结果判定;g)结果记录与统计.耐药性调查的实施５１样品采集５１１采样对象水产养殖动物,每尾(个)动物个体为一个样品.５１２

采样频次每个采样点每年至少３次,每次间隔２个月或以上.５１３采样数量每个采样点每次采集不少于１０个样品,全年不少于３０个样品.５１４样品采集、保存及运输样品采集后分别放置于清洁、干燥、密封的容器中,且存放温度为０℃,应在内进行细菌分离.每个样品分别加贴采样标签,注明采样地、采样编号、采样人和采样日期.５２信息采集采样人员记录养殖场基本信息和样品来源信息.按附录

A的要求填写采样记录表.５３细菌分离鉴定根据不同细菌分别选择适宜的培养基、培养条件和鉴定方法.对样品进行细菌分离培养,采用生理生化反应和分子生物学等方法对分离菌株进行菌种鉴定.每个样品分离菌株１株~２株,每个采样点每年分离菌株不少于３０株.５４菌株保存分离的菌株若不能及时进行药物敏感性试验,应置于０℃~４℃

冰箱中保存,时间不超过４８h;或按照的规定,采用甘油保存法或真空冷冻干燥法,置于－２０℃或－８０℃冰箱中保存.５５药物敏感性试验采用微量肉汤稀释法对分离菌株进行药物敏感性测定.具体操作方法和步骤按附录B的规定进行.５６结果判定根据不同抗菌药物对受试菌的

MIC值结果,将菌株判定为敏感、中介或耐药.不同细菌的耐药性判定参考值见附录C.５７结果记录与统计１ ２ ３将每一受试菌的菌株编号、菌种名称、对各种药物的

MIC结果以及判定结果记录于药物敏感性１ ２ ３结果记录表中,见附录D.按照公式()、公式()、公式()分别计算分离菌株的敏感率、中介率及耐药率.１２３敏感率＝(敏感菌株数/受试菌株总数)×１００％

()１２３中介率＝(中介菌株数/受试菌株总数)×１００％

()耐药率＝(耐药菌株数/受试菌株总数)×１００％

()２场名:联系人:电话:地址:主要养殖品种::□

≤１０□１１~１００□

＞１００养殖模式::□~２□~５□动物品种:样品数量::;采样部位:发病情况:使用抗菌药物情况:():():采样时间:

SC/T

７０２８—２０２２附录A(规范性)采样记录表采集养殖场基本信息和样品来源信息等按表

A１的要求填写.表表A１采样记录表药物名称储备液浓度μg/mL溶剂稀释剂氟苯尼考３２０９５％

磺胺间甲氧嘧啶２０４８０c２５mol/LNaOH

a磺胺甲

１２１６０c２５mol/LNaOH

a６４０００５mol/L,１０％cb８０/２,mol/LNaOH

盐酸多西环素１６０a,,,.b,.c,.SC/T

７０２８—２０２２附录B(规范性)药物敏感性试验(微量肉汤稀释法)B试剂和材料B１１抗菌药物B１１１标准品氟苯尼考、盐酸多西环素、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲

唑、甲氧苄啶和恩诺沙星等.B１１２抗菌药物储备液的制备B１１２１抗菌药物粉剂的称量B Bμ抗菌药物粉剂应在分析天平上称量,并且根据公式(B Bμ重量(mg)＝浓度(g/mL)×容量(mL)÷含量(％)×０００１

(B１１２２溶剂与稀释剂各药物的溶剂与稀释剂见表试验用水应符合

中三级水的要求.表B１抗菌药物储备液所用的溶剂和稀释剂B１１２３溶剂与稀释剂将称取的抗菌药物溶解于无菌水或溶剂中表B１抗菌药物储备液所用的溶剂和稀释剂B１１２３溶剂与稀释剂４制备完的药液,置于４℃冰箱中保存,

周内使用.４B１２水解酪蛋白(,MH)肉汤培养基按产品说明用干粉培养基配制

MH

肉汤,试验用水应符合

GB/T６６８２中三级水的要求.针对需要复杂营养的细菌,应在

MH

肉汤里添加适宜其生长的物质.B１３质控菌株E大肠埃希氏菌(scherichiacol

EB１４９６孔板宜选用规格１０７mm

×１００mm×１６９mm、聚苯乙烯材质、U型孔底、带盖、每孔可容纳液体的无菌９６孔板.B仪器设备恒温培养箱、恒温摇床、高压灭菌锅、分析天平、电热鼓风干燥箱、冰箱、移液器、超净工作台等.B抗菌药物稀释取灭菌

MH

肉汤,在无菌９６孔板的第１孔加入１６０μL,在第２孔至第１０孔中分别加入１００μL.在第１孔中加入抗菌药储备液４０μL,吹打混匀;取第１孔中的含药肉汤至第２孔中吹打混匀;吸取４药物名称,μg/mL１０１１１２氟苯尼考A３２１６０５０２５０１２５００６阳性对照空白对照盐酸多西环素B１６０５０２５０１２５００６００３阳性对照空白对照磺胺间甲氧嘧啶C２０４８１０２４５１２２５６１２８６４３２１６阳性对照空白对照磺胺甲

/甲氧苄啶D６０８/３２３０４/１６１５２/９５/０５４３/０２５２４/０１２１２/００６阳性对照空白对照恩诺沙星E０５０２５０１２５００６２５００３００１５阳性对照空白对照注:“阳性对照”为不含药液的菌悬液;“空白对照”为不含药液和不含菌悬液

MH

肉汤.药物类别药物名称MIC,μg/mL酰胺醇类氟苯尼考４~１６四环素类多西环素０５~２磺胺类磺胺甲

/０６/００３~４８/０２５磺胺间甲氧嘧啶８~３２喹诺酮类恩诺沙星０００８~００３SC/T

７０２８—２０２２第２孔中的含药肉汤至第３孔中吹打混匀.重复上述操作,将药物进行２倍倍比稀释,当第１０孔稀释完后弃去吸出的含药肉汤１００μL,使含有药物的

MH

肉汤每一孔均为１００μL.B细菌

MIC值测定B４１菌悬液制备根据不同细菌分别选择适宜的培养基和培养条件,将纯化的受试菌株接种于适宜的培养基中,取对数生长期的培养物,用比浊仪或麦氏比浊管测定校正菌液浊度为０２５~１麦氏浊度标准,再用

MH

肉汤稀释２００倍,制备成用于接种的菌悬液(菌悬液浓度为４０×１０

CFU/mL~１６×１０

CFU/mL).B４２对照设立配制的菌悬液应在１５min内加入已稀释好抗菌药物的９６孔板第１孔至第１０孔中,每孔各１００μL.设不含抗菌药物的菌悬液作为阳性对照,设不含药物和菌悬液的

MH

肉汤作为空白对照.每一受试菌株单独使用一块９６孔板.接种后,每孔抗菌药物的终浓度见表

接种后菌液的终浓度为２０×１０CFU/mL~８０×１０

CFU/mL.表B２抗菌药物在９６孔板中各孔的终浓度B４３孵育加样完毕后,盖好板盖.将表B２抗菌药物在９６孔板中各孔的终浓度B４３孵育菌分别选择适宜的培养条件.B４４MIC值判读空白对照孔不得有细菌生长,阳性对照孔有明显的浑浊才可判读.没有细菌生长的孔所对应的最低浓度为

MIC值.如存在一个跳孔现象时,应读最高的

MIC值,多于一个跳孔时应重测.B质量控制测定每一批次受试菌前,应测定质控菌株大肠埃希氏菌

ATCC２５９２２对试验药物的

MIC值,对配制的药物及药物稀释过程进行质量控制,测定方法见不同抗菌药物的质控范围见表如果质控菌株的结果明显偏离质控范围,应查找原因重新配制药物进行测定或从指定菌种保藏机构更换新的标准菌株.表表B３大肠埃希氏菌ATCC２５９２２质控范围５药物类别药物名称,μg/mL敏感中介耐药酰胺醇类氟苯尼考≤２≥８四环素类盐酸多西环素≤４≥１６a≤１ba≥２磺胺类磺胺甲

/≤３８/２≥７６/４a≤９５/０５a１９/１~３８/２a≥７６/４磺胺间甲氧嘧啶≤２５６≥５１２喹诺酮类恩诺沙星≤０５１－２≥４a

,

/,.b“—”.SC/T

７０２８—２０２２附录C(资料性)细菌耐药性判定参考值表C１给出了细菌对不同抗菌药物的耐药性判定参考值.表表C１细菌耐药性判定参考值采样点