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电泳技术--等电聚焦电泳等电聚焦电泳—电泳技术大纲1.等电聚焦电泳概念2.等电聚焦电泳特点3.等电聚焦操作等电聚焦电泳—电泳技术将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH值梯度的凝胶介质中，在电场内经过一段时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH值位置上，最后，样品的各组分在各自的等电点聚焦成一条清晰而稳定的窄带。（一）等电聚焦电泳概念等电聚焦电泳—电泳技术①使用两性载体电解质，在电极之间形成稳定、连续、线性的pH梯度；②由于“聚焦效应”，即使很小的样品也能获得清晰、鲜明的区带界面；③电泳速度快;④分辨率高;（二）等电聚焦电泳特点等电聚焦电泳—电泳技术⑤加入样品的位置可任意选择；⑥可用于测定蛋白质类物质的等电点;⑦适用于中、大分子量（如蛋白质、肽类、同工酶等）生物组分的分离分析。（二）等电聚焦电泳特点等电聚焦电泳—电泳技术

（1）凝胶配制：凝胶浓度T为5％-7.5％

（2）加样：任意位置（三）等电聚焦电泳操作等电聚焦电泳—电泳技术（3）电泳

①开始电泳时恒压60V，15min，目的在于使小分子的，泳动快的载体两性电解质可在短时间内形成一个粗略的pH梯度。

②此后，恒流为8mA，是为了避免电泳开始时介质中带电颗粒较多，电泳电流过高而破坏凝胶。（三）等电聚焦电泳操作等电聚焦电泳—电泳技术③当各种蛋白质逐渐泳动，到各自等电点位置时，带电颗粒逐渐减少，出现电阻增大，电压随之增高现象。（三）等电聚焦电泳操作等电聚焦电泳—电泳技术④当电压升到550V时，带电颗粒已大为减少，电流不再偏高，故恒压到580V，继续电泳120min后，蛋白质颗粒慢慢地集中到它等电点位置。⑤电流接近于零时，蛋白质颗粒不再泳动，电泳也到此结束。

（三）等电聚焦电泳操作等电聚焦电泳—电泳技术（4）固定及染色：

TCA固定，考马斯亮蓝染色。（5）等电点测定：Marker与未知样品同时电泳染色后，以pH值为纵轴，距阴极距离为横轴，做p

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