药物电泳技术-聚丙烯酰胺凝胶电泳（制药技术课件）

电泳技术--SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳技术大纲1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳操作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳技术

SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后，使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。（一）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳技术SDS（十二烷基磺酸钠）能打开蛋白质分子间的氢键和疏水键，破坏蛋白质的高级结构使其变性为松散的线状。SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇使二硫键打开，引起蛋白质构象改变，使蛋白质－SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同，长轴与蛋白质分子量成正比。（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳技术（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理蛋白质—SDS复合物在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。两者关系：蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳技术（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理

将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据其相对迁移率，即可在标准曲线上求得分子量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳技术操作：即变性及非变性）1.制胶:（变性：buffer（电泳缓冲液）中加0.4%SDS）

a.分离胶：根据待分离样品的分子大小，选择一定浓度的分离胶，配制分离胶溶液：（丙烯酰胺:亚甲基双丙烯酰胺溶液）Acr:Bis=29:1，分离胶buffer,过硫酸铵（AP），四甲基乙二胺（TEMED），水。迅速倒胶，加水使液面平坦，室温0.5h聚合完全。

b.浓缩胶：用浓缩胶buffer。插上梳子。（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳操作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳技术2.样品制备：

a.PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）:样品＋样品缓冲液（蔗糖或甘油＋指示剂溴酚蓝）

b.SDS:样品＋样品缓冲液（SDS，甘油，巯基乙醇，溴酚蓝），煮沸2~5min，以除去亚稳态聚合。（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳特点SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳技术3.加样及电泳：

SDS:电极buffer（缓冲液）中加0.1%SDS，溴酚蓝距下端1cm时停止电泳。（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳特点SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳技术4.固定及染色a.固定

将凝胶浸于7％乙酸或12.5％TCA中固定蛋白质组分。b.染色

常用方法有考马斯亮蓝染色法、银染法（灵敏度比前者高100倍）其它的染色方法：氨基黑、阿尔辛蓝，过碘酸－Schiff试剂。（三）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳操作高电压SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳技术--聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳技术大纲1.聚丙烯酰胺凝胶电泳概念2.聚丙烯酰胺凝胶电泳特点3.聚丙烯酰胺凝胶电泳分类聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳技术聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE是以丙稀酰胺为单体、亚甲基双丙稀酰胺为交联剂，通过自由基诱导聚合所形成的，具有一定网状结构的凝胶为载体的电泳。（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳概念聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳技术

电泳过程中，样品分子的迁移速率，除受自身电荷大小影响外，还与样品分子的大小和形状密切相关（即凝胶载体的分子筛效应），具有很高的分辨率。

PAGE可用于蛋白、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量制备，还可用于测定分子量和等电点。（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳概念聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳技术（1）一定浓度范围内凝胶透明（易于电泳过程观察监测），且在270nm无吸收（便于蛋白及核酸电泳后的扫描检测），有弹性，机械性能好；（2）化学性质稳定，不与被分离物质起化学反应，并在很多溶剂中不溶；（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳特点聚丙烯酰胺凝胶电泳装置及分离原理聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳技术（3）对pH和温度变化稳定，操作条件一致时，样品分离重复性好；（4）对样品吸附作用小，且聚合物不带电荷，电渗作用小；（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳特点聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳技术（5）凝胶孔径大小可调控，具有可控分子筛效应；（6）分辨率高（不连续PAGE集浓缩、分子筛和电荷效应一体）。（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳特点聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳技术根据是否存在浓缩效应可分为连续PAGE和不连续PAGE。（1）连续PAGE

电泳体系中缓冲溶液pH值及凝胶浓度相同，带电分子在电场的作用下主要依靠电荷和分子筛效应实现分离。（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳分类聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳技术（2）不连续PAGE

电泳体系中由于缓冲溶液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电分子在电场中涌动不仅有电荷效应、分子筛效应，还有浓缩效应，因此分离条带的清楚度和分辨率均有所提高。（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳分类垂直板电泳装置聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳技术不连续PAGE系统的组成：①电极缓冲液：pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液；②样品胶：无需专门制备，只需在样品液中加入等体积40%的蔗糖溶液即可；（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳分类聚丙烯酰胺电泳分离聚丙烯酰胺凝胶电泳—电泳