树突状细胞与肿瘤免疫治疗

树突状细胞与肿瘤免疫治疗AntigenThcellAntigenprocessingpresentingAPCSpecificimmuneresponseTh1Th2BcellCTLplasmacellAntibodyThecoreofspecificimmuneresponseistheeffectiveactivationoflymphocytesafterantigenrecognition.Thepresentationofantigenisthekeyelementofspecificimmuneresponse.2

1975年美国国立癌症研究所(NationalCancerInstitute,NCI)Rosenberg等提出生物应答调节剂(biologicalresponsemodifier,BRM)的概念，开创了肿瘤生物治疗的新里程碑。一些研究发现，灭活的肿瘤细胞、肿瘤细胞裂解物、肿瘤抗原蛋白、肿瘤细胞DNA，联合某些细胞因子或佐剂能在荷瘤个体产生一定的治疗效果，但疗效较为低下，难以达到完全缓解，延长荷瘤个体生存。3树突状细胞(dendriticcells,DC)是功能最强的APC，能有效摄取、加工及提呈抗原，刺激初始型T细胞的增殖和活化，是启动、调控并维持免疫应答的中心环节。将DC修饰成为一种“自然”疫苗正成为一种能激发强大而持久抗肿瘤免疫应答新的手段。充分理解DC的生物学特性则有助于制备更为有效的免疫治疗疫苗。4PartIDCBiology51.DC的形态和表面标志若要鉴定所得到的细胞是否为DC，往往是通过形态学、组合性细胞表面标志、MLR中刺激初始型T细胞增殖三个方面加以综合判断，即具有典型树突状形态、膜表面高表达MHCⅡ类分子、能够移行到淋巴器官和刺激初始型T细胞活化增殖，并具有一些相对特异性表面标志的一类细胞62.DC的来源及分化成熟DC分为髓系和淋巴系两大群体人髓系DC是近年来研究和运用最被关注的DC亚群，业已在肿瘤免疫中得到广泛应用人髓系DC主要包括：从CD34+造血细胞诱导分化获得的；从单核细胞诱导获得的Mo-DC；存在于皮肤、呼吸道上皮及消化道粘附上皮的郎罕氏细胞（LC）7髓系DC是具有不同的分化发育阶段的特殊免疫细胞群，业已建立了体外对髓系DC分化发育阶段及其功能研究的模型和方式。据此可将髓系DC分化发育分为四个期：前体期、未成熟期、迁移期、成熟期，各阶段DC有不同的功能特点。8未成熟DC成熟DC存在部位非淋巴组织、器官外周淋巴组织表达MHCⅡ类分子数量/细胞~106~7×106表达共刺激分子、黏附分子－或低＋＋表达FcR，CR，TLR＋＋－产生的细胞因子TNF-α,IL-1,IL-6IL-12,IL-4,IL-18表达趋化因子受体CCR1,2,5CXCR1,2CCR7,CXCR4主要功能摄取、处理抗原提呈抗原未成熟DC和成熟DC的特点9PrecursorPopulationsAnatomicalLocalizationFunctionTheFinalOutcomeofImmuneResponse3.DC的异质性104.DC对抗原的摄取、处理、提呈DC能通过内吞、胞饮、胞吞等方式摄取细菌、坏死细胞、蛋白质以及免疫复合物。摄取的抗原降解成为抗原多肽，并和MHCI或MHCII类分子结合，进而转运至膜表面，为抗原特异性T细胞识别。

内源性抗原：MHCI类途径外源性抗原：MHCII类途径Cross-presentation:外源性抗原通过MHCI类途径加以提呈，可使DC激发CD8+T细胞和CD4+T细胞免疫应答，这可为设计抗原使其能通过两种途径得以提呈提供思路。11EfficientAntigenCapturing12

DC的成熟信号主要是由病原体成分或机体炎症、损伤组织释放的因子作用（危险信号）所介导，

是由一系列因子触发胞内信号转导所完成。

机体产生的炎症因子包括，sCD40L、TNF-α、IFN-α、IL-1；微生物成分以及损伤组织所释放的分子则通过Toll-likereceptors(TLR)完成信号转导。5.DC的成熟13

胞吞作用减弱，形成p-MHCI和p-MHCII复合物能力增强细胞骨架延伸迁徙至淋巴组织T细胞区(CCR1,5,7)

促进趋化因子的产生，招募单核细胞、DC、特定的T细胞亚群激发T细胞能力增强表达一些特征性膜分子，CD83、DC-LAMP

上调黏附分子和共刺激分子的表达，参与免疫突触的形成介导细胞因子的分泌，调节免疫应答的进程

DC成熟后发生一系列和功能密切相关的生物学改变，如：146.DC的体外培养及应用DC在组织中含量甚微，细胞表面缺乏特征性的标志，不易与其它细胞分离。细胞来源的困难一度限制了对DC生物学特性等方面的深入研究目前用于临床和实验研究的DC大多是通过体外分离DC的前体细胞，在含有有关细胞因子的培养体系中诱导获得15如何在体外获得大量的功能性DC是DC疗法治疗肿瘤需要解决的关键环节骨髓、脐血、外周血CD34+细胞或外周血单个核细胞均可作为体外培养DC的来源适当的细胞因子配伍和应用顺序对DC的培养具有重要作用16PartIIManipulationofDCforCancerImmunotherapy17树突状细胞疗法是具有潜在应用前景

的肿瘤免疫治疗手段DC治疗前DC治疗后18手术复发DC治疗肿瘤消失再次复发树突状细胞疗法是具有潜在应用前景的肿瘤免疫治疗手段19国外早在1995年已开展了DC治疗肿瘤的Ⅰ期临床试验,国内直到2006年开展了应用DC肿瘤疫苗进行肿瘤治疗的临床试验；综合近年来对不同肿瘤的Ⅰ/Ⅱ临床试验结果，总的说来，多数能够产生一定的治疗效果。尤其表现在前列腺癌和恶性黑色素瘤，目前已经进行到Ⅱ/Ⅲ期的临床治疗方案，临床缓解率基本上可以达到30％。其他肿瘤，包括结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、脑胶质瘤、肾细胞癌等也已经开始了DC的临床应用，其疗效因肿瘤的不同而各异。

20DC抗肿瘤免疫治疗的主要机制肿瘤特异性抗原的有效递呈诱导产生大量效应T细胞启动效应T细胞迁移到肿瘤部位保持效应T细胞在肿瘤部位的长期存在抑制肿瘤血管的生成主要目的是诱导患者机体产生肿瘤特异性的、持久的免疫应答21DC与肿瘤免疫逃逸DC能否与已存在的肿瘤接触从而摄取并加工肿瘤抗原，有实验证实，某些肿瘤细胞低表达GM-CSF，抑制DC向肿瘤部位迁移；肿瘤细胞通过分泌细胞因子抑制DC向淋巴结迁移；早期的肿瘤细胞不产生LPS、TNF-α等细胞因子，当肿瘤细胞的增殖到达一定程度，细胞出现坏死、凋亡或周围组织有炎性浸润时，DC才被激活，而此时肿瘤已无法为免疫系统所控制；肿瘤细胞分泌的IL-10、TGF-β、VEGF等抑制DC的分化发育和功能22****23

CD34+造血干细胞来源的DC

单核细胞来源的DC

患者外周血中分离获得的DC

肿瘤细胞来源的DC1.DC的来源24——CD34+造血干细胞来源的DC骨髓、脐带血中含有相对较多的CD34+细胞，在GM-CSF和TNF-

的微环境中诱导2周后，能够分化为CD1a+CD83+HLA-DR++的成熟DC，加入IL-4可以增加DC细胞的纯度，但不能够扩增产量，但FL、SCF或IL-3能够大大提高收获的DC细胞量；CD34-DC可能比Mo-DC具有更强的抗原提呈能力

诱导往往需要两步法，需要大量的细胞因子，花费较高。此外适合患者HLA配型的骨髓与脐带血的获得也有一定的难度

25——单核细胞来源的DCGM-CSF和IL-4（或IL-13）可以诱导CD14+的单核细胞向DC分化，加入TNF-

、CD40L或单核培养基可以促进DC成熟在数量上Mo向DC分化没有扩增效应，但外周血中含有大量的Mo并且可以通过其贴壁特性而分离，经体外诱导培养的DC可以避免肿瘤微环境的抑制作用，所以为多数临床试验采用。用GM-CSF动员后的外周血中单核细胞的比例更高，并且含有一定数量的前体细胞，能够获得增殖DC可由外周血单个核细胞直接诱导而来，和贴壁细胞来源的DCs相比，PBMC来源的DCs表达更高的共刺激分子CD86、CD40和MHC-П类分子26——患者外周血中分离获得的DC

从外周血中直接分离DC，简单快速，可以不经过体外长期培养的过程直接获得，并且具有较强的同种刺激T细胞增殖的活性但DC在外周血中的比例很低（在未经动员的情况下，只占到PBMC的0.15%~0.7%，或(3~17)×106DC/L血液），不能够获得足够的细胞量限制了其使用；某些肿瘤患者来源的血液DC，可能存在数量上的减少和功能上的缺陷27——肿瘤细胞来源的DC白血病细胞来源的DC282.DC的抗原负载291）采用TAA多肽负载DCs

优点可简化临床过程，省去从每个患者中分离肿瘤抗原的程序，无需取得肿瘤组织或细胞，安全性好，易于检测所诱导的免疫应答；抗原纯度高，可以增强疫苗的免疫效率；所诱导的免疫反应具有肿瘤抗原表位特异性，没有无关抗原的存在，有效避免了非特异性免疫应答对正常组织的损伤，进一步减少了针对自身组织的自身免疫反应30不足之处1)大多数肿瘤尚未明确TAA；2)针对CD8+CTL识别表位的抗原多肽不能诱导产生特异性CD4+Th，后者在持续性CTL激发中起到重要作用；3)应用受到MHC配型限制，而且同种肿瘤的不同患者对某种TAA多肽的反应存在差异性；4)已知的TAA只有一部分属于肿瘤排斥抗原，并不一定能诱导最佳的抗肿瘤免疫反应；选用单一肿瘤抗原可能会由于抗原突变，出现肿瘤逃逸的风险1）采用TAA多肽负载DCs

312）采用肿瘤全细胞抗原负载DC

可以不必明确和制备肿瘤细胞的TSA或TAA，节省病人花费，并且可以有效诱导机体产生多克隆的CD4+Th和CD8+CTL目前采用的肿瘤全细胞抗原主要包括肿瘤细胞裂解物、酸洗脱肿瘤细胞表面的蛋白分子，凋亡肿瘤细胞及其释放的凋亡小体等粗提物

能够提供MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ两类途径的抗原表位，减少了抗原突变所致肿瘤逃逸的风险322）采用肿瘤全细胞抗原负载DC

需要足够的肿瘤组织，这对于微小肿瘤及难以手术切除肿瘤的的患者来说，具有一定的限制应用粗提物由于其中含有正常组织的成分，可能会引起自身免疫反应由于肿瘤特异抗原的浓度不足，粗提物DC疫苗诱导肿瘤特异性免疫应答的效率会比较低332）采用肿瘤全细胞抗原负载DC

需要足够的肿瘤组织，这对于微小肿瘤及难以手术切除肿瘤的的患者来说，具有一定的限制应用粗提物由于其中含有正常组织的成分，可能会引起自身免疫反应由于肿瘤特异抗原的浓度不足，粗提物DC疫苗诱导肿瘤特异性免疫应答的效率会比较低343）采用肿瘤抗原核酸负载DC

利用已知的肿瘤特异抗原核酸序列转染DC，可以获得持续表达肿瘤抗原的DC疫苗，节省了需要大量提纯或合成肿瘤抗原的程序采用目的DNA转染DC，制备DNA肿瘤抗原DC疫苗，可以使DC内源性地表达肿瘤抗原分子，并以DC自身内源表达蛋白相似的途径递呈MHCⅠ类分子限制性抗原35采用肿瘤细胞RNA负载DC可以从很少量的肿瘤细胞中通过体外扩增和转录获取足量RNA不需要对肿瘤抗原作具体的鉴定，可以通过差异削减杂交寻找并富集到肿瘤限制性RNA，从而可以避免诱导针对自身抗原的自身免疫反应。RNA半衰期短，不会整合到基因中，提高了临床应用的安全性RNA容易降解，对操作技术要求很高36非病毒载体介导法转染的DC应用安全性高，但转染效率不高，并且对细胞具有较强的毒性病毒载体存在安全隐患，载体表达的病毒蛋白可能影响DC活性及诱发非肿瘤特异性免疫应答，以及存在病毒基因与DC基因随机重组的可能性374）采用DC与肿瘤细胞的融合体

肿瘤细胞与DC融合，可获得既具有独特肿瘤特异性抗原又具有DC协同刺激作用的杂合体，这种杂合体细胞表达肿瘤特异性抗原、MHCⅠ、Ⅱ类抗原和协同刺激分子，既具有肿瘤细胞的全套抗原成分，又具有DC强大的抗原提呈能力

384）采用DC与肿瘤细胞的融合体

但是肿瘤细胞-DC融合细胞的制备类似杂交瘤细胞系建株，方法繁琐，杂合细胞生物学特性的不确定性以及有一定风险，限制了临床应用395）MHC-限制性抗原肽可通过分子改建增强针对低免疫原性抗原的免疫应答、增强抗原提呈以及增加TCR亲和力；不足之处在于需HLA配型、p-MHC复合物半衰期短、高亲和力表位对低亲和力表位的竞争抑制作用40目前认为采用全蛋白、灭活肿瘤细胞或肿瘤细胞裂解物作为抗原产生的临床疗效最为显著，这可能由于这些外来抗原可以通过交互致敏的方式同时激发CD4+T细胞CD8+T细胞。

Timmerman等采用肿瘤特异性独特型免疫球蛋白负载DC，在10例滤泡淋巴瘤患者获得了2例CR，1例PR。

Holtl等采用肿瘤裂解物冲击DC，并每月回输一次，对35例转移性肾癌患者进行疗效观察，在观察的27例患者中，2例CR，1例PR，7例病情稳定。

O’Rourke等报道，17例转移性黑色素瘤患者在接受放射灭活的肿瘤细胞负载的DC治疗，完成全部疗程的12例患者中3例CR，3例PR，并且长期的DC疫苗治疗可能更有助于更好的控制病情。在难治性皮肤T细胞淋巴瘤患者经过肿瘤裂解物冲击的DC治疗也取得了令人鼓舞的疗效。413.DC的剂量选择目前公认的剂量约为106～107，在不低于105

的情况下均可行。静脉途径需要的数量较高，而皮下或皮内途径只需很少的DC但是最近也有研究表明注射剂量和效应之间并无明显的相关性，相反，注射部位的选择更加重要。424.DC的输注途径和时间

淋巴结内注射(i.n)皮内注射(i.d)

静脉注射(i.v)瘤体内注射43皮下免疫实验动物DC肿瘤疫苗，能够按照预期的目的进入引流淋巴结。但人体的研究发现皮内注射只有0.1%~0.4%的标记细胞出现在淋巴结静脉注射，DC首先聚集在肺脏、然后是肝脏、脾脏，表明它们不能有效地进入淋巴结44淋巴结内注射、瘤体内多点注射是高效的免疫途径，而且DC的绝对数只需要(1~2)

106即可诱导机体产生特异性的免疫应答，但这种操作方法需要一定的技术45相同剂量的DC采用不同部位注射，其结果有很大差别：皮内注射DC约有1%到达外周淋巴结，静脉注射DC则停留在肺、肝和脾中免疫途径对免疫应答的类型具有深刻的影响:

皮内注射倾向于产生Th1型免疫应答，而静脉注射倾向于Th2型免疫应答

46DC疫苗注射时间

目前尚无统一的时间，一般根据动物模型和人的某些疫苗的接种经验，采用每周一次或每月一次47伴随的细胞因子或佐剂GM-CSFFLCD40LIL-2,IL-4485.DC疫苗的副作用过敏免疫耐受采用黑色素瘤细胞裂解物作为抗原负载的DC，在输入患者体内后，有约43%的患者出现了不同程度的白癜风；小鼠经有效的DC治疗后有可能导致糖尿病496.患者的免疫状态

目前的临床试验，受试对象多数为处于进展期的肿瘤患者，他们的免疫系统在一定程度上受到抑制。采用生物治疗的最佳候选其实是具有一定免疫功能的患者，因化疗或放疗而使免疫系统遭到深度损伤的患者常常丧失了生物治疗的最佳时机DC瘤苗可能在肿瘤患者发生瘤体消退但仍具有复发风险的情况下具有更重要的应用价值507.DC疫苗特异性免疫效果的评价特异性CTL的增殖水平以及杀伤活性；反映特异性细胞免疫应答和体液免疫应答的Th1和Th2细胞因子的相对水平（IFN-

、IL-4、IL-10）或抗辅助蛋白的IgG亚型；对肿瘤抗原或辅助蛋白的迟发超敏反应51SomeunansweredquestionsWhichDCshouldbeused?HowshouldtheDCbematured?Whatarethebestantigentouse?HowshouldDCbeloadedwithantigen?Shouldanadjuvantbeused,ifsowhat?WhatistheoptimumrouteandscheduleofdeliveryofDC?

52Whatarethebestteststopredictclinicalresponse?Whatclinicalandimmunologicaloutcomeshouldbemeasured?Whatstrategiesmaybeusedtoovercomethehostiletumorenvironment?Onceestablished,howcananeffectiveCTLresponsebestbemaintained?

Someunansweredquestions53以DC为物质基础的免疫治疗仍存在着一些亟待解决的问题体外进一步优化诱导DC成熟的方案并寻找有效的伴随的细胞因子佐剂；寻找最佳的抗原负载的方式；DC必须在趋化因子和其它信号的作用下迁移到淋巴组织，从而与T细胞相互作用并启动T细胞免疫应答，