血凝和血凝抑制实验1

鸡新城疫抗体检测（微量法）

血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验2024/6/17主要内容一、实验目的二、实验内容三、实验原理四、实验材料五、实验方法与结果判定六、注意事项七、新城疫背景介绍2024/6/17一、实验目的1、掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操作方法和结果判定方法；2、了解新城疫有关背景知识。

2024/6/17二、实验内容1、血凝试验(HA)检测新城疫抗原；2、血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体。2024/6/17三、实验原理1、血凝试验（HA）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应。病毒颗粒红细胞2024/6/172、血凝抑制试验（HI）原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。Iamlate！抗体抗原2024/6/17四、实验材料1、血凝板（2人/块）；2、新城疫标准抗原、阳性血清；3、被检血清（1份）；4、1％红细胞悬液；5、稀释液；6、移液器（10～100ul,2人/把）；7、枪头；8、3.8%枸橼酸钠溶液、阿氏液；9、5ml注射器一支/人。2024/6/17五、实验方法与结果判定血凝试验（HA)1、在血凝板上第一排的1～12孔内各加入25ul生理盐水；2、在第1孔内加入25ul病毒标准抗原，然后依次倍比稀释至第11孔，最后弃25ul；3、每孔加入1％鸡红细胞悬液25ul；4、轻轻振荡均匀，后放于室温或37℃中静置30min;5、结果判定。2024/6/17孔号1234567891011122×4×8×16×32×64×128×256×512×1024×2048×红细胞对照生理盐水252525252525252525252525抗原252525252525252525252525红细胞252525252525252525252525结果＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－－－－血凝效价测定2024/6/17结果判定标准1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100％凝集；2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即75％凝集；3、＋＋：红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即50％凝集；4、＋：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25％凝集；5、－：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集；2024/6/172024/6/17血凝价的判定以出现＋＋（50％凝集）的抗原最高稀释倍数为该抗原的血凝价（1:128）。25ul1:256稀释的病毒抗原为该抗原的一个血凝单位。稀释倍数2×4×8×16×32×64×128×256×512×1024×2048×细胞对照结果＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋————2024/6/17血凝抑制试验1、将病毒抗原稀释成4个血凝单位（1/128×4=1:32）2、在血凝板上1～12孔内各加入25ul生理盐水；3、在第1孔内加入被检血清25ul

，然后倍比稀释至第11孔，最后弃25ul；4、第1～12孔内加入4单位抗原25ul（第12孔为病毒对照）；5、每孔加入1％鸡红细胞悬液25ul；6、轻轻振荡均匀，后放于室温或37℃中静置30分钟；7、结果判定。2024/6/171234567891011122×4×8×16×32×64×128×256×512×1024×2048×病毒对照生理盐水252525252525252525252525被检血清2525252525252525252525254单位抗原252525252525252525252525红细胞252525252525252525252525结果－－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－血凝抑制效价测定2024/6/17结果判定标准1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100％凝集；2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即75％凝集；3、＋＋：红细胞形成一个环状，四周有下凝集块，即50％凝集；4、＋：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25％凝集；5、－：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集。2024/6/17血凝抑制价的判定以出现完全抑制凝集(即不凝集)的血清最高稀释倍数为该血清的血凝抑制价（1:4）。稀释倍数2×4×8×16×32×64×128×256×512×1024×2048×血清对照结果——＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—2024/6/17六、注意事项遵守实验室要求和规章制度；红细胞用前请摇匀；用枪加样定要准，尽量不要有气泡；操作规范；结果判定有耐心；HA和HI勿相混。2024/6/17七、新城疫背景介绍2024/6/17鸡新城疫

（NewcastleDisease，ND）

2024/6/171、概述

ND是由NDV（NewcastlediseaseVirus,NDV）引起的高度接触性和高度毁灭性的急性败血性传染病。1926年首先发生于印尼，同年发现于英国新城；我国1928年有该病记载；是当今全球范围内最严重的家禽传染病之一；被国际兽疫局（OIE)列为A类传染病。2024/6/17

别名：新城疫、亚洲鸡温、伪鸡瘟。鸡瘟：

禽流感、欧洲鸡瘟、真性鸡瘟。2024/6/17新城疫病毒，属副粘病毒科，副粘病毒属。病毒颗粒表面具有血凝素蛋白，可以刺激机体产生血凝抑制抗体。2、病原体2024/6/172024/6/17

根据临诊表现和病程长短分为：（1）最急性型：突然发病，病变不明显，见于雏鸡及本病流行初期。3、病状及病理变化2024/6/17（2）急性型：侵害消化系统为主，也称嗜内脏速发型。病状特点：a.食欲减退，饮水增加，离群呆立，眼睛半开半闭，翅膀下垂，冠、肉髯呈紫黑色。b.嗉囊积液、体温升高、呼吸困难。鼻腔内有大量分泌物，严重拉稀粪便呈黄绿色或褐色，有时混有血。2024/6/172024/6/172024/6/17c.死亡率高,非免疫鸡感染后可以80%～100%死亡。d.部分患鸡出现神经症状，头颈歪向一侧而咀向上，母鸡产蛋下降。2024/6/172024/6/17病变特点：全身的粘膜和浆膜出血，突出病变在消化道。A.腺胃粘膜水肿，粘膜上的乳头及其周围有出血点，间有溃疡。B.腺胃与肌胃、腺胃与食道交界处粘膜可见到出血点或出血带。2024/6/17C.小肠、直肠、泄殖腔粘膜充血、出血或有坏死，D.盲肠扁桃体出血。2024/6/17小肠、盲肠和浆膜出血，肠黏膜有斑状出血，黏膜水肿，盲肠扁桃体出血和坏死。2024/6/17皮下脂肪出血2024/6/17脑膜充血出血，卵黄性腹膜炎。产蛋母鸡卵巢的卵泡出血2024/6/17有的病鸡表现眼结膜炎2024/6/17

（3）亚急性型（非典型ND，以侵害呼吸道为主）也称肺脑炎型：其主要的特点：是症状及病变不典型。症状：多见4～35日龄鸡，25日龄前后最常发病。呼吸困难，精神沉郁，继而较早地出现神经症状，此时出现歪头，扭颈，角弓反张，倒地不能起立。2024/6/17病变：喉头及气管粘膜水肿，出血、充血、并有大量粘液，肺呈紫黑色（肺出血性炎症）。硬脑膜下树枝状充血，并有出血点。心冠、脂肪有出血点。发病率高，死亡率较低。2024/6/17

（4）慢性型（非典型ND）母鸡：轻者只表现产蛋率下降（约10-30%），产软壳蛋。重者出现精神沉郁，呼吸困难，黄绿色稀粪，喉头、气管粘膜充血、出血，个别病例出现消化道病变。2024/6/175、诊断

1、血凝抑制试验（HI）：监测鸡群中的HI抗体，评价疫苗的免疫效果及鸡体内的抗体水平。2、分离病毒：鉴别弱毒及野毒。（1）分离病毒：强毒：24～72小时鸡胚死亡，弱毒一般不死。2024/6/176、免疫灭活疫苗（激发体液免疫）活疫苗（激发体液免疫、细胞免疫和局部粘膜免疫）

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