谷物种子蛋白质中赖氨酸含量的测定

谷物种子蛋白质中赖氨酸含量的测定一、实验目的掌握茚三酮比色法测定氨基酸含量的原理和方法,测定谷物种子蛋白质中赖氨酸含量。二、实验原理

蛋白质中的赖氨酸具有一个游离的ε-NH2，它与茚三酮试剂反应生成蓝紫色物质，其颜色的深浅在一定范围内与赖氨酸的含量成线性关系。因此，用已知浓度的游离氨基酸制作标准曲线，通过比色分析（530nm）即可测定出样品中的赖氨酸含量。

亮氨酸与赖氨酸的碳原子数目相同，而且仅有—个游离氨基(ε-NH2)，所以通常用亮氨酸配制标准液。但由于这两种氨基酸分子质量不同，以亮氨酸为标准计算赖氨酸含量时，应乘以校正系数1.1515，最后再减去样品中游离氨基酸含量。

三、实验仪器

1．电子分析天平（1/1000）、可见分光光度计、恒温水浴箱、干燥器、移液器。

2．试管架（塑及铝）、具塞试管、具塞三角瓶、细口瓶、漏斗（或0.45um滤膜）、吸管等。四、实验试剂1．0.4mol/L柠檬酸缓冲液：称取4.202g柠檬酸和5.88g柠檬酸三钠，溶于100ml蒸馏水中。

2．茚三酮试剂：称40mg二氯化锡(防腐)溶于25ml柠檬酸缓冲液中；称lg茚三酮溶于25ml95％乙醇中；将上述两液混合摇匀，滤去沉淀，上清液置冰箱中保存备用。

3．0.02mol/L盐酸：取12mol/L盐酸0.17ml，用蒸馏水稀释定容至100ml。

4．亮氨酸标准液：准确称取20mg亮氨酸，加数滴0.02mol/L盐酸使之溶解，然后用蒸馏水稀释定容到100ml，则得浓度为200μg／ml的标准液。

5．60％乙醇。

6．4％碳酸钠：称取4g无水碳酸钠，溶于100ml蒸馏水。

7．2％碳酸钠。五、操作步骤1．标准曲线的制作。

取7支具塞试管，按表进行编号、加入试剂，顺序操作。以第1管为空白，在530nm波长下比色，读取吸光度值。并以吸光度值为纵坐标，亮氨酸含量（μg）为横坐标，绘制标准曲线。

2．样品前处理

不同品种的玉米种子，用粉碎机粉碎，过

80～100

目筛子，收集过筛后的细粉，放入广口瓶中，加入沸程

60

～

90℃的石油醚，使其淹过粉面，浸泡

8

小时，不时摇动进行脱脂。然后过滤，并用石油醚淋洗沉淀若干次，弃去滤液。将脱脂玉米粉凉在干净的滤纸上，置阴凉通风处吹干石油醚。收集干粉，置于干燥器内，保存备用。

3．样品的测定

取15mg已粉碎脱脂的玉米样品于具塞干燥试管内，加2％碳酸钠1.0ml，于80℃水浴中提取20min，然后加茚三酮试剂2.Oml，继续保温显色30min，冷却后加60％乙醇3.Oml，混匀后过滤或离心，然后在530nm波长下比色。

六、实验结果

样品中赖氨酸的含量（%）=[从标准曲线上查得值（μg）×10-3/(样品重mg)]×1.1515×100%-C

校正系数：1.1515；C：游离的氨基酸含量七、注意事项

1．各种作物种子中游离氨基酸含量是：玉米0.01％、小麦0.05％、水稻0.01％、高粮0.04％。

2．茚三酮显色反应受温度、pH、时间影响较大，如果要使实验结果能很好重复，必须严格控制上述条件。样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不易显色。

标准曲线的制作及样品测定参考表

试

管

号试剂1#(空白)2#3#4#5#6#7#(样品)亮氨酸标准液(ml)00.10.20.30.40.5／蒸馏水(ml)0.50.40.30.20.10／亮氨酸含量(μg)020406080100／4％碳酸钠(ml)0.50.50.50.50.50.5／脱脂样品(mg)／／／／／／152％碳酸钠(ml)／／／／／／1.0称取1g茚三酮和1g氯化镉（