T-QMHIPA 001-2024 人肝内胆管癌类器官培养与鉴定

CCSA40《人肝内胆管癌类器官培养与鉴定》CultureandIdentificationofPatient-DerivedOrganoidsforIntrahepaticCholangiocarcinomaI II 2规范性引用文件 3术语和定义 4缩略语 5伦理要求 6场地及环境要求 7样本采集 8肝内胆管癌类器官的构建、传代、冻存、复苏及处置 9关键参数及检测方法 10生物安全 参考文献 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起本标准在全国团体标准信息平台审核并发布。本文件由青岛市医养健康产业促进会提出并组织实施。本文件由青岛市医养健康产业促进会牵头归口。本文件起草单位：青岛海尔生物科技有限公司、青岛市医养健康产业促进会、青岛市中心医院、青岛市市立医院、山东大学齐鲁医院（青岛）、青岛大学附属医院、青岛大学、西安交通大学、武汉大学中南医院、哈尔滨医科大学、五邑大学、山东大学齐鲁医院、襄阳市第一人民医院、山东省第一医科大学、安徽医科大学、健康医疗大数据山东省工程研究中心、万链数科（青岛）投资控股有限公司、烟台鲁东医院；青岛华大医学检验所有限公司、青岛华赛伯曼医学细胞生物有限公司、青岛中德华大基因生物科技有限公司、青岛瑞源细胞科技开发有限公司、青岛市计量技术研究院、青岛瑞思德生物科技有限公司、青岛慧全钰智能科技有限公司、青岛赛尔斯干细胞库有限公司；广东省奥干诺伊德生物科技有限公司、浙江弘瑞医疗科技有限公司、中山阿拉丁生物科技有限公司、宁波海益生物科技有限公司。本文件起草人：曹启龙(青岛市医养健康产业促进会执行会长)、王琳、李云霄、王飞、姚雪瑞、初相伍、李沙沙、金南衡、薛杨、贾庆佳、罗国安、王义明，蔡金贞、曹俊宁、芦琳琳、裴斌、董佑红、张冬冬、杨铁林、郭燕、魏永长、郭源、关鸽、田蓝天、李红梅、曹彩霞、王栋、李菁、曹俊、李英花、王颖翠、史光军、张思浩、纪顺师、苑学礼、郑鸿平、李栋、王芝辉、王志卫、高青、刘成龙、于亚平、王丛先、陈梦梦、邢海峰、金继荣、邓婧、孙建、汪岚、王立平。本标准属首次发布。1人肝内胆管癌类器官培养与鉴定本文件规定了人肝内胆管癌类器官的伦理要求、技术要求和检测方法。适用于患者来源的人肝内胆管癌类器官的培养和鉴定。本文件适用于基于人肝内胆管癌类器官开展个体精准医疗和药物开发等研究和转化。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，标注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不标注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。WS213丙型肝炎诊断WS293艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准WS299乙型病毒性肝炎诊断标准中华人民共和国药典（2020年版）全国临床检验操作规程GB/T38736-2020人类生物样本保藏伦理要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1类器官organoids由干细胞或前体细胞体外培养形成，有组织器官特异性的多种细胞组成，具有特定器官关键结构和功能特性的三维（3D）细胞培养物。3.2患者来源肿瘤类器官patient-derivedorganoids(PDOs)由患者的肿瘤组织或其他含肿瘤细胞的样本中提取的肿瘤细胞经体外培养形成的，可以在一定程度上重现原始肿瘤病理形态、遗传特征和治疗反应特征的肿瘤类器官。3.3人肝内胆管癌类器官patient-derivedorganoidsforintrahepaticcholangiocarcinoma由《人原发性肝癌诊断指南》2022为依据诊断为肝内胆管癌的患者的手术切除组织体外3D培养而成的，在遗传特征、特征基因表达上与肝内胆管癌具有相似生物学特性的类器官培养物。3.4传代passage体外培养的类器官经过物理、化学或酶消化处理的方法，将原有类器官分成更小细胞簇甚至是单细胞悬液，重新接种到与原培养条件相同的新培养体系中进行体外培养的过程，新接种的类器官将与原培养物具有相同的结构形态及遗传特征。3.5冻存cryopreservation2类器官暂时脱离生长状态并保持其细胞组成、基因表达特征及功能特性的低温冻存过程。3.6复苏thawing将处于深低温冻存的类器官取出迅速恢复至培养温度，使其继续维持正常生长状态的过程。3.73D培养基质胶3Dextracellularmatrixgel由层黏连蛋白、IV型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白等组成。3D培养基质胶在室温条件下能够聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜结构和功能，为体外类器官的培养和分化提供支架。3.8细胞计数cellcounting使用细胞计数仪或血球计数板对组织消化成的单细胞进行细胞数量统计的过程，通常在肿瘤组织接种前对细胞进行计数。3.9知情同意informedconsent指组织提供者被告知组织提供后的各种情况（包括但不限于研究应用、风险、获益等）后，确认同意捐赠组织的过程。该过程应当以书面的、签署姓名和日期的知情同意书作为文件证明。4缩略语下列缩略语适用于本文本。HBV：乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）HCV：丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）HIV：人免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）TP：梅毒螺旋体（TreponemaPallidum）STR：短串重复序列（ShortTandemRepeat）5伦理要求5.1人肝内胆管癌类器官来源组织的采集、处理以及应用等应获得伦理委员会批准。5.2组织采集前应与供者签署书面的合法有效的知情同意通知书，始终秉承“尊重、公正、互惠、不伤害”的伦理原则，充分告知，包括但不限于：可能影响构建成功的因素及成功率、合适条件下潜在研究及治疗的应用、研究成果潜在的商业应用及其他问题所适用的内容。5.3应对类器官原组织提供者个人信息进行隐私保护，保障供者的利益、国家生物样本安全和信息安全。6场地及环境要求6.1实验室设施和设备要求应符合《实验室生物安全通用要求》GB19489现行版本的BSL-2及以上的技术要求，洁净程度应满足“C+A”及以上洁净度要求。6.2必要时对相邻区域进行有效隔离，采取相应措施避免交叉污染。7样本采集37.1应建立样本采集的供者评估和筛选标准、采集方法、运输标准和交接标准，保证供者和组织的安全。需提供样本的获取方式和途径以及相关的临床资料，包括供者的一般信息、既往病史、家族史等。既往史和家族史要对遗传病（单基因和多基因疾病，包括心血管疾病和肿瘤等）相关信息进行详细采集。7.2供体应筛查确认无HIV、HBV、HCV、TP等外源病毒因子等感染。7.3样本的采集与处理应由接受过专业培训的医护人员/工作人员进行。7.4肿瘤组织切取时以供血丰富区域为佳，应避开有明显坏死、灼烧和电刀损伤区域，且组织块应不小于5mm×5mm（每块不小于0.5g）。新鲜组织应在离体30min内切取，并置于保存液中并尽快处理，保存时间不建议超过2小时。7.5采集的每个样本应有唯一的标识符，以确保在进入实验室后的整个培养鉴定过程均可以识别其身份。8肝内胆管癌类器官的构建、传代、冻存、复苏及处置8.1肝内胆管癌类器官构建肝内胆管癌肿瘤组织经过清洗、酶消化成单细胞，用基质胶和完全培养基的混合物重悬后接种至24孔板中，进行原代培养。详细步骤参见附录B。8.2肝内胆管癌类器官传代肝内胆管癌肿瘤组织分离培养的类器官称为原代类器官，原代类器官体外培养一般不超过14天。原代类器官达到一定数目和体积后酶消化为单细胞或更小细胞簇，然后接种至新的基质胶与培养基中进行培养。详细步骤参见附录B。8.3肝内胆管癌类器官冻存暂不使用的肝内胆管癌类器官消化为单细胞或更小细胞簇后，加入冻存保护剂，经程序降温后，转移至液氮环境中冻存。详细步骤参见附录B。8.4肝内胆管癌类器官复苏肝内胆管癌类器官复苏遵循速融原则。使用37℃水浴令其尽快融化，融化后接种至新的基质胶与培养基中进行培养和传代，培养基组成应与冻存前培养基组成相同。8.5肝内胆管癌废弃类器官处置肝内胆管癌类器官构建和传代过程中产生的废弃物、不合格的或者污染的类器官应遵循生物医疗废弃物处理规范，送至有医疗废弃物处理资质的企业进行废弃处理。废弃物处置过程应严格按照生物样本处置与管理规范操作。9关键参数及检测方法9.1形态人肝内胆管癌类器官在倒置光学显微镜4倍物镜下可见边缘清晰的囊泡型结构和多细胞组成的细胞团结构。传代后类器官均呈囊泡型生长，囊泡的平均直径应控制在50~75μm。9.2存活率4将消化离心后的细胞沉淀用AdvancedDMEM/F12培养基重悬，对细胞悬液进行细胞计数，以活细胞比例＞80%表示制备的细胞活力良好。类器官单细胞悬液细胞数不宜低于1×106cells/ml。计数方法详见附件A。9.3体外培养及生长9.3.1从肝胆管癌患者来源的肝胆管癌组织或细胞，初次在体外培养成人原代肝胆管癌类器官后，应能在体外维持培养2个月，且应能在体外多次传代。9.3.2当类器官传代后，应能进行体外重建成为新的类器官，重建的类器官和传代前类器官的形态特征应保持一致。9.4数量体外三维培养类器官可通过倒置显微镜进行拍照，显微镜附带比例尺进行类器官的直径测量并进行统计。类器官的个数可进行直接计数。9.5微生物按照《中华人民共和国药典（2020年版）》中“1101无菌检查法”进行真菌和细菌检测，结果应为阴按照《中华人民共和国药典（2020年版）》中“3301支原体检查法”进行支原体检测，结果应为阴性。按照WS293核酸法检测、WS299核酸法、WS213核酸法检测HBV、HCV、HIV结果均应为阴性。按照《中华人民共和国药典（2020年版）》中“3302外源病毒因子检查法”检测外源病毒因子，结果均应为阴性。9.6STR体外培养的类器官，可自行或送至有鉴定资质的检测机构进行STR检测及分型鉴定。类器官应与供体STR分型一致。9.7病理特征9.7.1类器官染色后，由具备病理鉴定资质的专业人员进行判定，其组成细胞应具有肿瘤细胞的特异性特征如核深染、异常核分裂象、核质比失调等。9.7.2人肝内胆管癌类器官的免疫组化标志蛋白包括上皮标志性蛋白EPCAM、胆管标志性蛋白CK7和CK19，细胞干性蛋白LGR5、SOX9应呈阳性且表达分布不具极性，与原始肿瘤表达一致。具体操作步骤详见附录A。9.8遗传特征应对类器官进行基因变异检测，检测的基因应包括但不局限于KMT2C、PTCHD3、FMN2、USP2、ARID1B、RTK、HDAC5等，检测结果应与原肿瘤组织的基因变异结果一致。10生物安全在样本采集、培养、保藏及鉴定过程中涉及生物安全相关内容的，应遵守《中华人民共和国生物安全法》的相关规定。（规范性）肝内胆管癌类器官鉴定A.1单细胞悬液细胞定量评估在类器官传代前应用消化酶消化成单细胞悬液。可使用自动化细胞计数仪进行计数。将离心后的细胞沉淀充分拍打均匀（因肝胆管癌细胞黏性较大，不容易混匀），之后用5mLAdvancedDMEM/F12培养基重悬，经吹打混匀后吸取20μl细胞悬液进行细胞计数，以活细胞比例＞80%表示制备的细胞活力良好。类器官单细胞悬液细胞数不宜低于1.5×106cells/ml。人工使用血球计数板计数的方案同样适用。A.2肝胆管癌类器官的形态学及免疫标记鉴定肝胆管癌类器官成功构建后，通过制备冰冻切片或者石蜡包埋切片，苏木素/伊红染色（H&E）进行形态学鉴定，通过免疫荧光或者免疫组化染色进行生物标志物检测，从而确定类器官是否来源于肝胆管癌。肝胆管癌类器官可以不同程度地表达EPCAM、CK7和CK19、LGR5、SOX9。6（规范性）肝内胆管癌类器官构建、传代及冻存步骤B.1肝内胆管癌原代分离培养操作步骤去除标本上的坏死组织及脂肪组织，将样本在含200U/mL青链霉素的AdvancedDMEM/F12基础培养基中洗涤2次以上，然后将组织尽量剪碎至1mm3左右大小；将剪碎的组织加入终浓度为2.5mg/mLCollagenaseIV和0.1mg/mLDNaseI的预热组织消化液中，放置于水浴锅中进行消化。待大部分组织消化完全后，向上述消化液中加1-3倍体积的AdvancedDMEM/F12基础培养基或者1-3倍体积Hank‘s终止消化，将上述液体过100μm细胞筛后180×g离心5min；用AdvancedDMEM/F12完全培养基重悬清洗一次，获得单细胞悬液，再次离心获得沉淀。将上述沉淀用AdvancedDMEM/F12完全培养基重悬，之后加入等体积已经融化的基质胶充分混合均匀，在24孔板中每孔接种50μL，置于培养箱中正置培养3～5min，待半凝固后倒置10～15min，待其完全凝固后加入完全培养基进行正置培养。完全培养基组成详见表1。上述培养物每隔2天进行全量换液。B.2传代及冻存显微镜下观察待每孔出现数个直径大于50μm的类器官囊泡时，吸弃完全培养基，每孔加入500μL37℃预热的TrypLE消化液，转移至离心管中，37℃孵育5min，加入终止液终止。600×g离心5min，冻存时沉淀用冻存液重悬后进行程序降温后转至液氮存储。传代时沉淀处理步骤参照B.1中最后一步用AdvancedDMEM/F12完全培养基重悬后接种及换液程序进行。B.3复苏培养冻存类器官在37℃水浴中解冻，放入完全培养基稀释后600×g离心5min，去除上清后离心留存沉淀。用细胞计数仪计数后，用基质胶和完全培养基混合重悬后按照步骤2程序接种至孔板中。表1肝内胆管癌类器官完全培养基主要成分8参考文献[1]T/CSCB001-2020干细胞通用要求[2]T/CSCB0014-2022人肠癌类器官[3]国家卫生健康委，涉及人的生命科学和医学研究伦理审查办法，2023[4]中国抗癌协会肿瘤多学科诊疗专业委员会，中国抗癌协会肿瘤内分泌专业委员会.肿瘤类器官诊治平台的质量控制标准中国专家共识（2022年版J］.中国癌症杂志,20