(高清版)GBT 40249-2021 斑节对虾杆状病毒病诊断规程 PCR检测法

ICS65.020.30斑节对虾杆状病毒病诊断规程国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T40249—2021本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出。本文件由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。本文件起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站。许华。1GB/T40249—2021本文件规定了斑节对虾杆状病毒病诊断规程中普遍适用的核酸检测技术的要求，针对斑节对虾杆状病毒(Penaeusmonodon-typebaculovirus,MBV),给出了PCR检测法所需试剂或材料、仪器设备、本文件适用于对虾各生活期样品中MBV带毒情况的定性检测，以进行斑节对虾杆状病毒病的流2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文GB/T28630.4—2012白斑综合征(WSD)诊断规程第4部分：组织病理学诊断法本文件没有需要界定的术语和定义。bp:碱基对(basepair)DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)HCl:盐酸(hydrogenchloride)NaOH:氢氧化钠(sodiumhydroxide)PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)SDS:十二烷基硫酸(sodiumdodecylsulfate)Taq:水生栖热菌(thermusaquaticus)TE:Tris盐酸和EDTA缓冲液(EDTATris·HCl)Tris:三羟甲基氨基甲烷(trishydroxymethylaminomethane)5.5蛋白酶K:按A.7配制。5.8酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)。5.9氯仿/异戊醇(24:1)。5.16引物261F(10mol/L):5'-AAT-CCT-AGG-CGA-TCT-TAC-CA-3',-20℃保存。5.17引物261R(10μmol/L):5'-CGT-TCG-TTG-ATG-AAC-ATC-TC-3',-20℃保存。5.18内参引物CF(10μmol/L):5'-TGC-CTT-ATC-AGC-TNT-CGA-TTG-TAG-3',-20℃保存。5.19内参引物CR(10μmol/L):5'-TTC-AGN-TTT-GCA-ACC-ATA-CTT-CCC-3',-20℃保存。23GB/T40249—20217样品斑节对虾(Penaeusmonodon)等易感对虾。参见附录B。采样数量、方法和保存运输应符合GB/T28630.4—2012中附录B的要求。7.3.2分子生物学检测时，仔虾或未达到0.5g样品可以合并样本，个体稍大的虾可取个体进行检测。所取样品分别置于1.5mL离心管中，立即进行DNA提取操作或暂时保存于-20℃。8试验步骤8.1DNA的提取设置阳性对照和阴性对照。8.1.2加入2.5μL20mg/mL蛋白酶K,至终浓度100μg/mL,混匀后置于50℃水浴3h,不时旋动。8.1.3将溶液冷却至室温，加入等体积平衡酚，颠倒混合10min,于10000r/min离心3min分离两相。8.1.4水相移至新1.5mL离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),颠倒混合10min,于10000r/min离心1min分离两相。离心1min分离两相。8.1.7用70%乙醇洗涤沉淀2次，每次10000r/min离心5min,小心弃掉上清，将沉淀于室温晾干。8.1.8加入100μL灭菌双蒸水溶解DNA。8.1.10可采用同等抽提效果的其他方法或使用商品化DNA提取试剂盒。8.2PCR扩增8.2.1PCR反应体系：按照表1的要求，加入除TaqDNA聚合酶以外的各项试剂，配制成大体积的预混物，分装保存于-20℃。临用前，加入相应体积的TaqDNA聚合酶，混匀，按1个反应体系/支分装到0.2mLPCR管中。分别加入各样品的模板DNA(质量浓度：50ng/μL～100ng/μL)1μL,同时设阳8.2.2将上述加有DNA模板的PCR管按以下程序进行扩增：94℃预变性5min;94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s,35个循环4GB/T40249—2021试剂试剂终浓度10×PCR缓冲液(无Mg²+)1×PCR缓冲液试剂试剂终浓度dNTPs(各2.5mmol/L)引物261R(10pmol/L)灭菌双蒸水—TaqDNA聚合酶(5U/μL)8.2.3每份样品均设立十足目生物内参对照，扩增十足目生物组织DNA的PCR反应体系按照表2的表2扩增十足目生物组织DNAPCR反应体系试剂·组成试剂试剂终浓度10×PCR缓冲液(无Mg²+)1×PCR缓冲液dNTPs(各2.5mmol/L)灭菌双蒸水TaqDNA聚合酶(5U/μL)注：25pL体系的模板量为1μL。8.2.4将上述加有DNA模板的PCR管按以下程序进行扩增：94℃预变性3min;94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1min,35个循环；72℃延伸5min;4℃保温。8.3.1配制1.5%的琼脂糖凝胶，加入10mg/mLEB至终浓8.3.2将5μLPCR反应产物与1μL6×载样缓冲液混匀后加入到加样孔中。同时设立DNA分子量标准对照。8.3.3在1V/cm～5V/cm的电压下电泳，使DNA由负极向正极移动。当载样缓冲液中的溴酚蓝指示剂的色带迁移至琼脂糖凝胶的1/2～2/3处时停止电泳，将凝胶置于紫外观察仪或凝胶成像仪下观察或拍照。8.3.4如果观察到预期大小条带，对PCR扩增产物进行测序。5GB/T40249—20219结果判定十足目生物组织样品在848bp处有特定条带，阳性对照在261bp处有特定条带，阴性对照在261bp处无条带且空白对照不出现任何条带，试验有检测样品在261bp处有条带，测序结果同参考序列(参见附录C)进行比对，结果符合的可判为PCR结果阳性；检测样品在261bp处无条带可判为PCR结果阴性。6(规范性)A.11水mol/LTris·HCl(pH8.0)gmL溶解后加入约42mL浓盐酸调pH接近8.0,冷却至室温，再用2.5mol/LHCl调整pH至8.0。加水定容至1000mLA.20.5mol/LEDTA(pH8.0)乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na₂·2H₂O)18.6g磁力搅拌，用2.5mol/LNaOH调节溶液pH值至8.0,完全溶解，定容至100mL。A.3TE缓冲液(pH8.0)1mol/LTris·HCl(pH8.0)10mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)2mL加水定容至1000mLA.41mg/mL胰RNA酶TE缓冲液(pH8.0)10mL加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2,加水定容至100mL。室温贮存。若溶液有结晶形成，用前加热融解即可。SDS微细晶粒易于扩散，称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作台区和天平上A.6抽提缓冲液1mol/LTris·HCl(pH8.0)lmL0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL1mg/mL胰RNA酶2mL10%SDS7GB/T40249—2021A.720mg/mL蛋白酶K蛋白酶K20mg溶解后分装于1.5mL离心管中(0.25mL/管),—20℃下保存。A.810mol/L乙酸铵乙酸铵77gA.950×电泳缓冲液Tris242g0.5mol/LEDTA(pH8.0)100mL50×电泳缓冲液20mL室温贮存。A.1170%乙醇无水乙醇70mLA.1210mg/mLEB贮存液磁力搅拌数小时以确保其完全溶解。室温保存于棕色瓶或用铝铂包裹的瓶中。GB/T40249—2021(资料性)斑节对虾杆状病毒病简介斑节对虾杆状病毒病(InfectionwithPenaeusmonodon-typebaculovirus)由斑节对虾杆状病毒(MBV)感染引起。国际病毒分类委员会(ICTV)将该病毒名称暂定为斑节对虾单核多角体病毒(Pe-moNPV),但在多数情况下该病原被称为MBV,为核多角体病毒属成员。核酸类型为双链DNA。该病毒可感染对虾属(Penaeus)、明对虾属(Fenneropenaeus)、囊对虾属(Metapenaeus)和沟对虾属(Melicertus)等多种对虾。除卵和无节幼体，其余各生长阶段均易感染，且通常存在持续性感染。严重感染MBV的野生雌性斑节对虾产卵时，会排出含MBV的粪便，从而污染虾卵，将病毒传给下一代。有分布，但在斑节对虾自然地理分布范围以外的野生对虾群体中未发现。MBV经肠道感染肝胰腺小管和中肠前段黏膜上皮细胞。受