(高清版)GBT 40183-2021 DNA甲基化的测定 焦磷酸测序法

ICS07.080国家标准化管理委员会IGB/T40183—2021本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中国标准化研究院提出并归口。育生物学研究所农业资源研究中心、河北师范大学。1GB/T40183—2021DNA甲基化的测定焦磷酸测序法1范围本标准规定了用焦磷酸测序法测定DNA甲基化的方法。本标准适用于动植物组织或体外培养细胞DNA甲基化测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法下列术语和定义适用于本文件。3.1.1DNA甲基化DNAmethylation在DNA甲基转移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移至碱基特定结构上的DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)4原理DNA经重硫酸盐硫化处理后，DNA双链中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，通过PCR将尿嘧啶转化为胸腺嘧啶，根据PCR产物中相应甲基化位点的胞嘧啶和胸腺嘧啶的比例进行定量。5试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。5.2动物基因组DNA提取试剂盒。5.3植物基因组DNA提取试剂盒。5.420pmol/μL焦磷酸测序用引物。2GB/T40183—20215.6DNA重亚硫酸盐快速转化试剂盒。5.7焦磷酸测序试剂盒。5.870%(体积分数)乙醇。取70mL无水乙醇加水稀释定容至100mL。5.9溴化乙锭溶液。称取1g溴化乙锭加水稀释定容至100mL,磁力搅拌至完全溶解，然后将溶液保5.1050×电泳缓冲液。称取242gTris溶于800mL蒸馏水中，加入57.1mL冰乙酸和100mL0.5mol/L乙二胺四乙酸溶液(pH8.0),再加蒸馏水定容至1000mL,室温保存，稀释50倍使用。5.112%(质量分数)琼脂糖凝胶。称取2g琼脂糖置于烧瓶中，加入100mL电泳缓冲液，加热使琼脂5.126×电泳加样缓冲液。称取0.25g溴酚蓝、40g蔗糖置于100mL烧杯中，加蒸馏水至完全溶解后定容至100mL。5.130.5mol/L乙二胺四乙酸溶液。称取18.61g乙二胺四乙酸二钠二水合物，加入80mL水，充分搅拌，用氢氧化钠调pH至8.0,然后定容至100mL。5.14标准相对分子质量DNA(100bp～2000bp)。6.3PCR仪。6.4水平电泳槽。6.5电泳仪。6.6低温离心机：最大离心力25910g。6.7凝胶成像系统。6.8核酸检测仪。6.9焦磷酸测序仪。6.10PCR管。7测定步骤7.1DNA提取按照动物或植物基因组DNA提取试剂盒说明进行提取。7.2DNA重亚硫酸盐转化按照DNA重亚硫酸盐快速转化试剂盒说明进行操作。7.3甲基化PCR扩增目的片段7.3.1PCR反应体系配制50μLPCR反应体系：以10ng～20ng重亚硫酸盐转化后的DNA溶液为模板，按照PCR试剂盒说明加入试剂，再加入焦磷酸测序引物对中的上下游引物各0.5pL,用水补足体积至50μL。在PCR仪上扩增。GB/T40183—20217.3.2PCR扩增产物电泳检测在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过琼脂糖凝胶；将3μL～6pLPCR扩增产物分别和适量6×电泳加样缓冲液混合，点样；以标准相对分子质量DN示剂迁移至凝胶中部；用凝胶成像系统观察电泳结果并记录；电泳检测合格的PCR产物用于测序。利用焦磷酸测序仪及焦磷酸测序试剂盒进行以下操作：在焦磷酸测序仪配套软件中生成运行程序，加载运行前试剂耗材和程序，将上样圆盘放入机器，按程序在相应的孔位加入10μL含生物素标