(高清版)GBT 40138-2021 南方菜豆花叶病毒检疫鉴定方法

ICSCCS65.020.01GB/T40138—2021南方菜豆花叶病毒检疫鉴定方法国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T40138—2021本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、广州1GB/T40138—2021南方菜豆花叶病毒检疫鉴定方法1范围本文件规定了南方菜豆花叶病毒的血清学和分子生物学检测方法。本文件适用于豆科植物植株及种子中南方菜豆花叶病毒的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4南方菜豆花叶病毒分类信息异名：菜豆花叶病毒4号Beanmosaicvirus4;南方菜豆花叶病毒1号Southernbeanmosaicvirus1;菜豆南方花叶病毒Beansouthernmosaicvirus分类地位：类南方菜豆花叶病毒目(Sobelivirales)南方菜豆一品红花叶病毒科(Solemoviridae)南方菜豆花叶病毒属(Sobemovirus)南方菜豆花叶病毒的其他信息见附录A。5方法原理南方菜豆花叶病毒的血清学特性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。根据南方菜豆花叶病毒与抗体之间的特异性反应，对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DoubleAntibodySandwichEnzymeLinkedImmunosorbentAssay,DAS-ELISA);依据南方菜豆花叶病毒的基因组特征建立反转录重组酶聚合酶扩增技术(ReverseTranscriptionRecombinasePolymeraseAmplification,RT-RPA)和荧光RT-PCR检测方法；通过这些方法的有效组合，判断样品是否带有南方菜豆花叶病毒。除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。2GB/T40138—2021DAS-ELISA试剂应符合附录B中的B.1;RT-RPA试剂应符合附录C中的C.1;荧光RT-PCR试剂应符合附录D中的D.1。高速冷冻离心机：最大转速15000r/min。微型瞬时离心机：最大转速7000r/min。旋涡振荡器：最大转速为2800r/m高压灭菌锅：最大压力为0.235MPa,可调控温度范围为105℃~135℃。紫外可见分光光度计：波长范围为220nm～750nm,波长精度为1nm,分辨率为3nm。金属浴：温度范围4℃~150℃,控温精度±0.3℃。荧光PCR仪：温度范围4℃~100℃,温度均一性±0.4℃。温度范围4℃~99℃。6.3用具待测样品为植株小苗时，挑选有疑似症状的部位取样，症状描述信息见附录A;未表现症状的植株分组(10株为1组)编号，将采集的每组样品分成3份，作为待检样品。待检测样品为种子时，挑选表皮皱缩、变小或有黑斑的种子；未表现症状种子分组(10粒为1组)编号，研磨成粉末，分成3份；在粉末中加入样品抽提缓冲液(B.1.5),充分浸泡后离心取上清液作为待检样品。3GB/T40138—20217.3种子样品种植制样将种子播种于灭菌土中，待长出3片～4片真叶后进行检测，取样制样同7.1。8检测鉴定8.1DAS-ELISA测定把制备的样品上清液加入已包被南方菜豆花叶病毒抗体的酶联板中，进行DAS-ELISA检测。每个样品平行加到两个孔中。健康的植物组织作为阴性对照，感染南方菜豆花叶病毒的植物组织作为阳性对照，样品提取缓冲液作为空白对照；其中阴性对照的植物种类和材料(如叶片)应尽量与检测样品相一致。具体操作按照附录B规定的方法进行。8.2RT-RPA检测RT-RPA检测阴性和阳性对照设置同8.1,灭菌双蒸水(ddH₂O)作为空白对照。分别提取样品和对照的总RNA后进行RT-RPA检测，具体操作按照附录C规定的方法进行。8.3荧光RT-PCR检测荧光RT-PCR检测阴性和阳性对照设置同8.1,灭菌双蒸水(ddH₂O)作为空白对照。分别提取样品和对照的总RNA后进行荧光RT-PCR检测，具体操作按照附录D规定的方法进行。9结果判定DAS-ELISA、RT-RPA和荧光RT-PCR中三种方法中任意两种检测方法的结果为阳性即可判定样品携带南方菜豆花叶病毒。10结果记录与样品保存联反应数值；RT-RPA检测应有电泳图片；荧光RT-PCR检测应有扩增曲线图。10.2样品保存阳性样品直接放于-80℃冰箱或冷冻干燥后放于-80℃冰箱，至少保存1年。保存的样品要做好4GB/T40138—2021(资料性)南方菜豆花叶病毒其他信息A.1寄主范围寄主范围窄。除千日红(Gomphrenaglobosa)外，只有豆科植物是易感寄主。能自然侵染菜豆(Phaseoluslunatus)和大豆(Glycinemax)等。A.2地理分布A.3症状菜豆(Phaseolusvulgaris):B株系和M株系引发局部褪绿斑或局部坏死，有些可系统侵染，有些不能系统侵染。菜豆上的系统侵染根据寄主的不同变种，其症状有轻重。轻者引起微弱花叶，重者造成严重花叶甚至新叶畸变。G株系通常诱发无症状表现的系统侵染(见图A.1)。大豆(Glycinemax):许多株系可引起较弱的系统斑驳。棉豆(Phaseoluslunatus):B株系诱发产生小坏死斑。其他株系不敏感。绿豆(Vignaradiata):株系G引起局部小坏死斑，有些分离物引起系统花叶。豇豆(Vignaunguiculata):株系G在某些过敏品种引起局部枯斑。系统症状表现为明脉、花叶和畸叶。图A.1南方菜豆花叶病毒侵染菜豆(左)和大豆(右)引起的症状A.4传播途径病毒可由叶甲传播；菜豆种传率为1%～5%,豇豆种传率为5%～40%;实验中易于机械接种传播。A.5粒体形态病毒粒子为等轴对称的二十面体(T=3),无包膜，直径约为30nm,有180个蛋白亚基。5GB/T40138—2021基因组为ssRNA,全长约4136nt,编码4个蛋白，分别编码21kDa蛋白、105kDa蛋白(推测为聚合酶)、18kDa蛋白和30kDa蛋白个VPg,可能是侵染所必需的。6(规范性)双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)B.1.1包被抗体特异性的南方菜豆花叶病毒抗体；宜使用商品化试剂盒抗体；4℃保存不超过1年；抗体使用时的稀释比例按说明书要求稀释。B.1.2酶标抗体碱性磷酸酯酶标记的南方菜豆花叶病毒抗体。对硝基苯磷酸二钠(pNPP)。B.1.41×PBST缓冲液(pH7.4)氯化钠(NaCl)磷酸二氢钾(KH₂PO₄)磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)氯化钾(KCl)吐温-20(Tween-20)溶于900mL灭菌双蒸水中，并定容至1000B.1.5样品抽提缓冲液(pH7.4)亚硫酸钠(Na₂SO₃)1.3g聚乙烯基吡咯烷酮(PVP,MW24000-40000)20.0g溶于900mL的1×PBST缓冲液中，并定容至1000mL,4℃储存。B.1.6包被缓冲液(pH9.6)碳酸钠(Na₂CO₃)碳酸氢钠(NaHCO₃)溶于900mL灭菌双蒸水中，并定容至1000B.1.7酶标抗体稀释缓冲液(pH7.4)牛血清白蛋白(BSA)聚乙烯基吡咯烷酮(PVP,MW24000-40000)溶于1000mL1×PBST缓冲液中，4℃储存。7GB/T40138—2021B.1.8底物缓冲液(pH9.8)二乙醇胺97mL氯化镁(MgCl₂)0.1g叠氮钠(NaN₃)0.2g溶于800mL灭菌双蒸水，用浓盐酸(HCl)调pH至9.8,定容至1000mL,4℃储存。B.2试验步骤B.2.1包被抗体按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体，每孔加100μL。酶联板加盖或用保鲜膜包好，37℃孵育2h。清空孔中溶液，用1×PBST缓冲液加满各孔，3min后倒掉孔中溶液，在吸水纸上拍干。再重复2次上述洗板过程。B.2.2样品制备与加样按照1g待测样品，5mL～10mL抽提缓冲液的比例，将待测样品与抽提缓冲液混合，在研钵中研磨；3000r/min离心5min,上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应处理或按说明书进行。按100μL/孔分别加入制备好的检测样品、阴性对照和阳性对照；酶联板加盖或用保鲜膜包好，4℃孵育过夜。酶联板用水彻底冲洗，再用1×PBST缓冲液洗涤3次，每次3min。B.2.3加酶标抗体按说明将酶标抗体稀释至工作浓度并加入酶联板中，100μL/孔，酶联板加盖或用保鲜膜包好，37℃孵育4h。酶联板用水彻底冲洗，再用1×PBST缓冲液洗涤3次，每次3min。B.2.4加底物B.2.5读数在不同的时间内如30min、60min、90min、120min或更长时间，用酶联仪在405nm处读OD值。B.3结果判定B.3.1质量控制要求对照孔的OD₄o5值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)应在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性对照孔的OD₄₀5值<0.15,当阴性对照孔的OD45值<0.05时，按0.05计算；阳性对照OD₄o5值/阴性对照OD₄5值>5;同一样品的重复性基本一致。B.3.2结果判定在满足B.3.1的质量控制要求后，结果原则上可判断如下：样品OD₄o₅值/阴性对照OD₄o5值>2,判为阳性；样品OD4o₅值/阴性对照OD₄o₅值为2时，判为可疑样品，需重做一次或用RT-RPA或荧光RT-PCR验证；样品OD₄05值/阴性对照OD₄05值<2,判为阴性。若不满足B.3.1的质量控制要求，则不能进行结果判断。GB/T40138—2021(规范性)C.1试剂C.1.1核酸提取及扩增试剂核酸提取试剂为Trizol或合格的RNA提取试剂盒。RT-RPA扩增试剂盒为TwistAmpBasicRTKits。三羟甲基氨基甲烷(Tris)242g冰乙酸(C₂H₄O₂)57.1mL乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)37.2g灭菌双蒸水定容至1000mL,用时稀释至1×TAE。C.2.1核酸提取RNA提取试剂盒进行操作。正向引物F:5'-TGGAAGCCCCGGCCACTCAATCGAGGAGGCCC-3';反向引物R:5'-ACTGTCACACCTCCAGCCGTTCTAAGCGATGGT-3'。扩增片段长度约169bp。C.2.3RT-RPA扩增2μL,醋酸镁(280mmol/L)2.5μL,双蒸水18GB/T40138—2021C.2.4产物检测反应结束后向上述RT-RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀后12000r/min离心2min,取5pL上清液按比例与电泳上样缓冲液混匀，用DNAMarker作为分子量标记，在1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳。电泳结束后在凝胶成像仪中观察是否扩增出预期的特异性DNA片段，并拍摄记录。C.3结果判定如果阴性对照和空白对照未出现片段，阳性对照出现预期169bp的片段，样品未出现预期大小的如果阴性对照和空白对照未出现片段，阳性对照出现预期169bp的片段，样品出现预期大小的片段，判定样品为南方菜豆花叶病毒。可通过序列测定和BLAST分析对PCR产物进一步确认，确认为南方菜豆花叶病毒的序列相似性为≥95%。9GB/T40138—2021(规范性)荧光RT-PCRD.1试剂核酸提取试剂同C.1.1。D.2引物探针荧光RT-PCR所用引物探针如表D.1。表D.1引物探针序列引物探针名称引物探针序列(5'-3′FPTTCCAATATGATATGGCTGACACFP1TGACTCATTGGCCTATATTGGAA-PCCAGAGGATCCAGACCAGA