T-WSJD 57-2024 食品中蜡样芽胞杆菌呕吐毒素的测定

ICS67.050WSJDDeterminationofBacilluscereuscereulideinfoodIT/WSJD57—2024 12规范性引用文件 1 1 1 16仪器设备与耗材 2 2 4 4 5 5T/WSJD57—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件中的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国卫生监督协会提出并归口。本文件主要起草单位：北京市疾病预防控制中心、中国食品药品检定研究院、天津市疾病预防控制中心、中国肉类食品综合研究中心。本文件主要起草人：崔霞、赵榕、范赛、崔生辉、张明月、李建平，郭文萍、张楠、王莉莉、陈东、刘彤彤、王雪硕。1T/WSJD57—2024食品中蜡样芽胞杆菌呕吐毒素的测定本文件规定了食品中蜡样芽胞杆菌呕吐毒素的测定方法。本文件适用于面米制品、乳及乳制品中蜡样芽胞杆菌呕吐毒素的测定，也适用于食物中毒呕吐物中蜡样芽胞杆菌呕吐毒素的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。试样中蜡样芽胞杆菌呕吐毒素经乙腈提取，采用固相萃取柱净化，超高效液相色谱-串联质谱除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。5.1试剂5.1.1乙腈（CH3CN）：色谱纯。5.1.2甲醇（CH3OH）：色谱纯。5.1.3氯化钠（NaCl）：优级纯。5.1.4甲酸（HCOOH）：色谱纯。5.1.5乙酸铵（CH3COONH4）：色谱纯。5.2试剂配制5.2.20.1%甲酸-2.0mmol/L乙酸铵水溶液：称取0.156g乙酸铵，以适量水溶解，然后加入5.2.30.1%甲酸乙腈溶液：取1.0mL甲5.3标准品5.3.1蜡样芽胞杆菌呕吐毒素标准溶液（C57H96N6O18，CAS号：157232-64-9浓度为25μg/500μL或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。5.3.213C6-蜡样芽胞杆菌呕吐毒素标准溶液（C5113C6H96N6O18，CAS号：1487375-69-8浓度为2T/WSJD57—20245.4标准溶液配制5.4.1蜡样芽胞杆菌呕吐毒素标准中间液（1.0mg/L准确吸取标准溶液（5.3.1）0.200mL，置于10.0mL棕色容量瓶中，用乙腈溶液定容至10.0mL，浓度为1.0mg/L的标准中间液，于—18℃冷冻保存，有效期3个月。5.4.2蜡样芽胞杆菌呕吐毒素内标标准中间液（1.0mg/L准确吸取标准溶液（5.3.2）0.500mL,置于10.0mL棕色容量瓶中，用乙腈溶液定容至10.0mL，浓度为1.0mg/L的标准中间液，于—5.4.3蜡样芽胞杆菌呕吐毒素标准工作液（0.1mg/L准确吸取标准中间液（5.4.1）1.0mL（1.0mg/L）置于10.0mL棕色容量瓶中，并用乙腈溶液稀释成0.1mg/L的标准工作液，—18℃冷冻5.4.4蜡样芽胞杆菌呕吐毒素内标标准工作液（0.1mg/L准确吸取内标标准中间溶液（5.4.2）1.0mL，置于10.0mL棕色容量瓶中，并用乙腈溶液稀释成0.1mg/L的内标标准工作液，于—18℃μL、500μL、1000μL分别置于10.0mL容量瓶中，加入200μL0.1mg/Lμg/L、5.0μg/L、10.0μg/L的标准系列溶液，含内标浓度为2.0μg/6仪器设备与耗材6.1仪器设备6.1.1超高效液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。6.1.3高速冷冻离心机：转速不低于10000r/min。6.1.4涡旋振荡器。6.2.1新型反相固相萃取柱（HLB-P200mg，6mL，或相当产品。6.2.2高效除脂硅锆骨架复合多孔材料固相萃取柱（HMR500mg，6mL，或相当产品。6.2.3有机相滤膜：0.22μm微孔滤膜（所选用滤膜应对目标物无吸附）。7.1试样制备7.1.1样本量大于250g的面米制品，采用多点取样法，取250g样品，按照1:3比例加水均质，制成食糜状试样，于—18℃以下冷冻保存；样本量小于等于250g的面米制品，则取全部样品，按照1:3比例加水均质，制成食糜状试样，于—18℃以下冷冻保存，取样前恢复至室温。7.1.2乳及乳制品混合均匀，于—18℃以下冷冻保存，取样前恢复至室温。7.1.3食物中毒呕吐物样品全部均质，于—18℃以下冷冻保存，取样前恢复至室温。7.2试样提取7.2.1食品试样提取称取1g（精确至0.01g）均质后的食品样品置于15mL离心管，加入内标标准工作液（5.4.4）(7.3样品净化T/WSJD57—20247.3.1食品样品净化HLB-P柱经3.0mL甲醇，3.0mL纯水依次活化，取食品样品提取液（7.2.1）上样（如果上柱溶液粘度较大，过滤较为缓慢，可以1.2mL/min速度抽滤过柱待上样液完全过柱后，以3.0mL纯水淋洗小柱，5.0mL甲醇洗脱，收集全部洗脱液，氮气浓缩至近干，残渣用1.0mL初始流动相（流动相A与B体积比为8:2）复溶，过微孔滤膜供上机测定。7.3.2食物中毒呕吐物样品净化吸取食物中毒呕吐物样品提取液（7.2.2）5.0mL，直接上HMR小柱净化，弃去前0.5mL过柱液后收集2.0mL过柱溶液，过膜供上机测定。7.4超高效液相色谱-串联质谱仪器参考条件7.4.1超高效液相色谱参考条件a)色谱柱：WatersACQUITYUPLCPeptideBEHC18Column，300Å色谱柱(2.1mm×100mm，1.7µm）或性能相当者。b)流动相：流动相A相为0.1%甲酸乙腈溶液，B相为0.1%甲酸-2.0mmol/L乙酸铵水溶液。c)流速：0.35mL/mind)柱温：40℃e)进样量：5µLf)梯度洗脱程序见表1。表1梯度洗脱程序时间(min)A(%)007.4.2质谱参考条件a)离子化模式：电喷雾电正离子模式（ESI+)；b)质谱扫描方式：多反应监测（MRMc)毛细管电压：3.5kV；f)脱溶剂气流量：1000L/h；g)碰撞室压力：0.36Pa；h)监测参数见表2。4T/WSJD57—2024表2蜡样芽胞杆菌呕吐毒素监测参数化合物保留时间母离子子离子参考碰撞能量蜡样芽胞杆菌呕357.0*13C6-蜡样芽胞杆菌呕吐毒素40.0注：*为定量离子。8.1标准工作曲线的制作将标准系列工作液分别注入超高效液相色谱-串联质谱系统，测定相应的蜡样芽胞杆菌呕吐毒素及其内标的峰面积，以各标准系列工作液的蜡样芽胞杆菌呕吐毒素浓度(µg/L）为横坐标，以蜡样芽胞杆菌呕吐毒素和13C6-蜡样芽胞杆菌呕吐毒素内标的峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线。8.2试样溶液的测定将试样溶液注入超高效液相色谱-串联质谱系统，测定相应的蜡样芽胞杆菌呕吐毒素及其内标的峰面积。试液中待测物的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应适当减少取样量后重新测定。8.3定性试样中蜡样芽胞杆菌呕吐毒素色谱峰的保留时间与相应标准溶液中色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在±2.5％之内。选择的蜡样芽胞杆菌呕吐毒素质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，且试样中蜡样芽胞杆菌呕吐毒素的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表3规定的范围。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度%>5020~50≤10允许的最大偏差%±20±25±30±509结果计算试样中蜡样芽胞杆菌呕吐毒素含量公式（1）计算：X——试样中待测蜡样芽胞杆菌呕吐毒素的含量，单位为微克每千克(µg/kgρ——由标准曲线得到的试样溶液中待测真菌毒素的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mLV——样品经净化洗脱后的最终定容体积，单位为毫升（mL5T/WSJD57—2024m——试样的取样量，单位为克（gf——提取液稀释因子，食品样品f=3，食物中毒呕吐物样品f=0.1