(高清版)GBT 42077-2022 生物技术 核酸靶序列定量方法的性能评价要求 qPCR法和dPCR法

评价要求qPCR法和dPCR法国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会 I 12规范性引用文件 2 7 6核酸靶序列定量的方法设计和优化 7数据质量控制与分析 8核酸定量测量方法的验证 附录A(资料性)分光光度法 23附录B(资料性)核酸完整性 附录C(资料性)PCR扩增效率 27附录D(资料性)测量不确定度 I本文件等同采用ISO20395:2019《生物技术核酸靶序列定量方法的性能评价要求qPCR法和1生物技术核酸靶序列定量方法的性能评价要求qPCR法和dPCR法本文件适用于数字PCR(dPCR)或实时定量PCR(qPCR)扩增技术对DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(rRNA)、信使RNA(mRNA);双链RNA,包括长链和短链非编码RNA[微小RNA(miRNA)和ISO/IEC指南98-3:2008测量不确定度第3部分：测量不确定度的表达指南(GUM:1995)[Uncertaintyofmeasurement—Part3:GuidetotheexpressionofuISO/IEC指南99国际计量词汇基本和通用概念以及相关术语(VIM)[Internationalvocabularyofmetrology—Basicandgene2GB/T42077—2022/ISO20395:2ISO/IEC指南99界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3GB/T42077—2022/ISO20395:2019定量循环差值deltaC₄将核酸模板分布在多个等体积的反应单元，每个反应单元中包含或不包含一个或多个拷贝的靶序列(核酸模板),对靶序列进行PCR扩增λ定量限limitofquantification;LOQ由给定的测量程序获得的测得值。其声称样品中不存在某种成分的误判概率为β,其存在某种成线性linearity用一种方法分析描述一定范围内提供与在实验室样品中测定的核酸靶序列的浓度和仪器响应信号4分析描述加热过程中DNA的双螺旋结构降解程度的曲线。由于DNA双螺旋是在一定温度范围内而不是在一个特定的温度下解离，当50%的双链DNA螺信使RNAmessengerRNA;mRNA无模板对照notemplatecontrol;NTC通过减去(C。标度)或除以(线性标度)反映非特定技术因素的一个或多个参数来修正核酸靶序列反应单元partitionsPCR分析PCRassay用指定的寡核苷酸引物(在某些情况下，还包括一个或多个探针)鉴定和/或量化核酸靶序列的5PCR效率PCRefficiencyE每一个PCR循环扩增得到的分子(产物)的量与模板的比值。实时定量PCRquantitativereal-timePCR将特定的DNA片段进行体外扩增与利用荧光信号积累实时检测和定量扩增过程中特定PCR产内参基因referencegene内源基因endogenousgene靶基因在每个生物样本中几乎以恒定的拷贝数浓度存在，对生物或实验条件变化引起的反应波动在适当的条件下，逆转录酶利用一个或多个寡核苷酸引物由以RNA为模板合成cDNA的过程。RT效率RTefficiency参与逆转录反应中实际转化合成cDNA的RNA模板的百分比。逆转录阴性对照RTminuscontro逆转录dPCRreversetranscriptiondPCR;RT-dPCR首先用逆转录酶将RNA链反转录生成与其互补的DNA(互补DNA或cDNA),然后以合成的cD-NA为模板使用dPCR进行扩增的过程。6GB/T42077—2022/ISO20395:2逆转录qPCRreversetranscriptionqPCR;RT-qP首先用逆转录酶将RNA链反转录生成与其互补的DNA(互补DNA或cDNA),然后以合成的cD-NA为模板使用qPCR进行扩增的过程。样本sample当基因组(或其他靶序列)中的单个核苷酸A,T,C或G与对照模板的差异而引起的DNA序列变测试样品testsample7GB/T42077—2022/ISO20395:20194.1通则片段的随机性以及实验过程的标准化。4.2～4.4概述了宜考虑的特定因素。在方法验证(8.2)中对拟4.2定量方法4.2.2qPCR标准曲线法测定核酸浓度标准曲线应使用具有特定的绝对或相对浓度且具有与测试样品相同或相似基质的标准品来构建如果分析RNA,则校准品/标准品应包含RNA,并以与测试样品转录步骤。如果分析环状DNA,则应先线性化去除所有的超螺旋。如果测试样品是单链DNA(例如曲线公式宜反映出1个单位的C₄值的差异。标准溶液的浓度应均匀地分布在整个待测样本浓度范围内，最好超出样 (1)a——标准曲线的截距；b——斜率。dPCR是一种终点测量的方法，具有无需使用标准曲线即可直接定量核酸靶序列的能力。含有测8GB/T42077—2022/ISO (2)Np——阳性反应单元数；Nr——反应单元总数。 (3)用于计算拷贝数浓度的分割体积应以仪器期间核查的经验值或已发表的积引入的测量不确定度应反映在拷贝数浓度的合成测量不确定度中(见10.4)。如果dPCR混合液和测试样本的稀释液是按照体积配制的，则测试样品的拷贝数浓度(copies· (4)如果dPCR混合液和测试样本的稀释液是按照重量配制的，则测试样品的拷贝数浓度(copies·如果模板是单链的，则估算的拷贝数浓度是指单链模板的拷贝数浓度。如果模板包含目标序列多4.2.4qPCR相对定量法在数据分析中计算的初始△C₄应基于使用同一PCR分析两个样本之间的C。值。不推荐用同一样本经过两次PCR扩增后的Cạ值来计算初始△C₄,因为该△C₉在目标数量方面没有可比性，且不同相对定量=(1+E)AC₄ (6)91:1比例的参考样品对两次PCR扩增下qPCR扩增效率可能出现的差异进行归一化。方法随时间变化的再现性，这是因为与使用标准曲线不同(参见4.2.2),该方法没有已知浓度的标准品且也不能在每个实验中都检测PCR扩增效率。的有效性。这些检查可以是诸如偏离假设分布的统计测试或量化位数图检验等方式。对于任如果使用对数转换后的数据进行统计分析，则置信区间和测量不确定度应在同一标度上。如果将足以覆盖两个非对称置信区间中最大的一个。4.2.5dPCR比值定量法确定同一测试溶液中的靶基因A和靶基因B的比率，可以使用双重dPCR检测。在双重测定条件应用归一化的定量方法应证明归一化方法是归一化策略总体来说消除了影响样本的非特异性信号，因此避免了非特异性扩增对靶基因测定的影响。通过有效的归一化策略可控制的技术因素包括来自采样、运输和储存过有许多方法可用于对技术差异进行归一化，其适用于DNA或mRNA(基因表a)基于内参基因归一化。定量基因组DNA(gDNA)时，数据可以归一化为一个或多个参考基因。宜评估多个基因组位点，以确保所选位点能代表基因组拷贝数。所使用的参考基因应对GB/T42077—2022/ISO对照对照典型组成列入原因阴性检测反应阶段的污染(用于DNA分析的qPCR/dPCR;分别用于RNA的1步或2步分析的RT-qPCR/dPCR或RT);检测非预期的扩增产物，如使用dsDNA结合染料时可能出阴性提取空白阴性RT(一)gDNA的扩增(用于mRNA检测)阴性照，不包含靶序列的模板表征和监测假阳性率(例如，用于SNVs的10NA;用于转基因检测的非转基因样品)阳性具有良好特性的生物材料或鉴定反应成分的功能，并评估PCR扩增效率；阳性阳性内参对照加内参基因的样本或空白基质确认没有发生抑制反应(QC为假阴性结果)注：对照类型来源自ISO24276。GB/T42077—2022/ISO c)具有RNA或DNA特异性的荧光法(见5.2.3)。d)靶gDNA的RT(一)对照反应或分析方法也适用于确定RNA样品中的gDNA污染(见使用dPCR/RT-dPCR和qPCR/RT-qPCR定量DNA和RNA方法设计的要求如下。6.1.2扩增子的选择设计引物的退火温度宜在50℃~68℃范围内，GC含量宜在40%～60%范围，同时没有任何明显的二级结构。引物对中的两条引物Tm之差宜在1℃~2℃。探针长度宜小于30个碱基。使用水解探针时，探针的Tm要求宜比引物的Tm至少高5℃。另与相似序列结合(例如，同一基因组内的同源基因)。如果引物对之间的区域足够小(<500bp),则可以异性模板和非特异性模板。如果通过最初的线上筛选鉴定出潜miRNA通常形成密切相关的序列家族，它们之间的差异仅为1bp～2bp,因此应针对相同体外测试(见6.2.5)。与原始miRNA和前体miRNA形式相比，对成熟miRNA的测定特异性也宜进生物信息学特异性分析宜包括针对特定基因组参考序列的BLAST搜索。交叉反应的影响宜在测对于使用基于oligo(dT)引物法合成cDNA的RT方法来说，由于mRNA转录片段断裂或逆转录应优化核酸定量检测方法性能。下面列出了为获得最佳检测性能而宜考虑可以从供应商购买基于核酸定量的检测方法。分析方法在用于分析之前对于dPCR,还需优化以最大程度地减少阴性和阳性簇群之间具有中等荧光幅度(对于实时dPCR系统为C₂)的反应单元数量。数字化分析(Rs)的分辨率是对两个正负簇(阳性和阴性)区分程度的定量度量。Rs定义为两个峰之间的荧光差异除以峰的合并宽度。对于较复杂的样本允许基本参数优化确定后(见6.2.2),应测定基于确定参数的qPCR或RT-qPCR的测量程序的PCR扩PCR扩增效率应通过校准曲线或稀释系列DNA(qPCR)或RNA(RT-qPCR)进行分析评估(见附录C)。对于RT-qPCR,应使用RNA校准品或一系列RNA稀释液进行校准，因为这样可以在适用的线性范围内验证相同的逆转录效率。对于RT-qPCR分析，还可以使用DNA校准品或稀释系列溶液来分析PCR扩增效率，以收集与逆转录步骤无关引物的PCR扩增效率信息。标准曲线或稀释系列溶液的斜率可以转换为效率值(见附录C)。(RT)-qPCR的效率宜在多个实验(至少3个)中进行评估，并宜计算置信区间以评估估计的准确性。在无干扰的情况下(参见6.3.1),PCR平均扩增效率宜为90%～110%(-3.6≥斜率≥-3.1)。线性应以相关系数(如皮尔逊相关系数R)表征。相关系数R²宜大于0.99。 8核酸定量测量方法的验证8.1通则核酸定量测量方法(qPCR和dPCR)应验证。ISO5725-1提供了方法验证的一般指导。方法验证 在8.2～8.7中给出了表征qPCR和dPCR测量程序的这些性能属性的要求，并在8.8和8.9中分别提供了对qPCR和dPCR的特殊考虑。8.2精密度精密度是在规定条件下，对同一被测样品独立重复测量所得的测得值间的重复测量(在实验范围内)和独立实验的次数应足以提供可靠的标准偏差(SD)估计。ISO5725-1分别根据公式(8)和公式(9)采用单因素方差分析(ANOVA)方法，计算相对重复性(Srpeat,ra)和相 (8) (9)MSin单因素方差分析计算的平方的批次内平均值；MSe单因素方差分析计算的平方的批次间的平均值；npi——每次运行的平均重复次数；8.3定量限应指定与L0Q相关的精密度，如SD或RSD。LOQ水平。LOQ估计的精密度取决于在每个浓度下的重复次数以及样品之间的浓度差异。每个浓度至少须重复10次，并且要小幅增加浓度(LOQ预期浓度GB/T42077—2022/ISO20395:2019(a)的概率(如p=0.05)或对真阳性(等于1-a)或假阴性(等于1-β)进行分类的置信度。测量程序的假阳性率应作为特异性评估(见6.2.5)和阴性对照分析(见4.4、6.3真正的阳性检出率宜通过在测量程序工作范围的下限范围内对含有靶估算，其中>0%和<100%的反应为阳性，并覆盖所要求的置信度范围。例如，在95%置信度下，LOD是95%的重复样本为阳性的最低检测浓度。宜使用具有已知数值和测量不确定度的标准品或阳性样品来表征真实的阳性检出率。如果进行稀释(体积法或重量法),则宜表征稀释液的精密度并将其用于将阳性平行样本的浓度与标准品的浓度作图，然后通过将数据拟合到S形曲线上以获得更好的精品之间浓度的增加。每个浓度水平至少宜进行10次重复。浓度的增量最大宜为两倍。系数R)来表征该范围内的线性度。测量值应是该方法测得的数值(见4.2),而不是经过进一步数据处理的中间数值(如C₄)(见7.4)。观察值与期望值的期望斜率为1.0,截距为(0,0)。建议斜率为0.95～1.05。相关系数R²宜大于测量正确度是该方法产生的无限个结果(即现实中的大量结果)的平均值度。有3种常用方法可获取合适的参考值：b)使用加标样品进行回收率实验；对于a),经认证的标准物质应具有与测试样本非常相似的基质，并且靶序列拷贝数浓度应与常规在稳健性测试中，宜研究相关方法参数中的小偏差对方法性能和测量结果的通常认为，作为终点定量PCR法的dPCR方法比qPCR方法更可靠，但是荧光幅度差异和Tm是Tm值。GB/T42077—2022/ISOCVc₄=³(1+E)Sc₂²×l¹+E)-19.3仪器校准用于核酸定量的仪器应使用适当的标准品和/或参考材料(如果有)进行校准。用于核酸定量的辅测量不确定度可以定义为测量的真实值所在的估计值范围，值的范围表示测量结果的可靠性。不确定度的评估包括测量过程中随机误差和系统误差的影响。在评估影响测量结果的不确定度因素时，宜考虑测量过程中所有可能的变化来源。附录D概述了qPCR和dPCR测量结果的不确定度来源。应映了影响测量结果的关键分析步骤。qPCR的参考文献和dPCR的参考文献提供了有关测量不确定度稀释的随机误差);不确定度应根据ISO/IEC指南98-3进行组合。用于计算具有指定置信度(如95%)的扩展不确定方法验证中进行的实验可提供有关精密度(见8.2)和正确度(见8.6)的信息，这些信息可用于计算根据重复性和试验运行间的估计(见8.2),可以使用公式(11)计算与测量样品平均拷贝数浓度的方Wbisra=√upin.a+u2nt,r…………(12)qPCR测量不确定度还应考虑PCR扩增效率的不确定度。PCR扩增效率是使用基于标准曲线的以用来估计分隔单元体积的不确定度。分配体积值宜适合所用的dPCR试剂(预混液)的 数之比为1.8,表明样品中大约有70%～80%的蛋白质。鉴于许多蛋白质可以同时抑制PCR和逆转GB/T42077—2022/ISO2YY210图A.1高质量DNA样品的分光光度读数示例输出显示220nm～350nm的吸光度以及DNA浓度(ng/pL)和吸光度的比值。图A.2低质量DNA样品的分光光度读数示例输出显示220nm～350nm的吸光度以及DNA浓度(ng/pL)和吸光度的比值。别的。对于原核RNA,使用23S和16S核糖体亚基的rRNA比值评估完整性。对于真核RNA,使用GB/T42077—2022/ISO20395:2至于DNA完整性，可以通过使用多个不同大小的扩增子测量相同的转录子，该方法可应用于RNA完整性分析GB/T42077—2022/ISOy=a+bx……将拟合参数c和d的重要性与斜率b进行比较。c和d的显著权重表明在低或/和高浓度下如果数据出现偏离线性的情况，则移除极端数据点，并检查现有覆盖较窄范围的剩余数据是种偏离可能是由于较高浓度的样本的荧光提前增加，被仪器软件识别而错误地减去基线。线归的影响较大，所以对线性拟合的影响也较为显著,导致PCR扩增效率的评估明显高于100%,理论上这是不可能的。此时，宜对基线设置方法进行调整，或在较窄的浓度范围内对包含标准误差(SE)[公式(C.5)]:CI=E±tgs%,-2×SEn——测定PCR扩增效率而进行的实验次数。GB/T42077—2022/ISO稀释特异性引物线性纯度完整性纯度完整性交叉污染回收率样本D.3dPCR的不确定度来源图D.2中说明了用于定量拷贝数浓度的微滴式dPCR测量程序的不确定度来源(见4.2.3)。阈值Df本加入PCR混合物前样品的稀释倍数；Ma+禅本——稀释液和样品的质量；注：经许可复制，见参考文献[58]。图D.2dPCR检测方法的不确定度贡献因果图检查项目EEDDED显微切割还是宏观切割?E处理程序EEE样本存储条件和时间[特别是福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)样品]EEEDE污染的评估(DNA或RNA)EEGB/T42077—2022/ISO检查项目E纯度(Az₆o/A2so)DDEE电泳D抑制物检测(C。稀释法、加标样品或其他)EEEEE温度和时间ED逆转录前后的C₄值DDEDEEDDD各引物的外显子或内含子位置(如果适用)EE引物序列ED探针序列D所有结合位点和修饰信息E引物制造商D检查项目DEE引物(探针)、Mg²+和dNTP浓度E聚合酶识别位点及其浓度EED添加剂(SYBRGreenI、DMSO等)EDEPCR反应的设置(手动或自动)DqPCR仪器制造商E最优化条件的证据(根据梯度实验)D特异性(凝胶电泳、测序、熔解曲线或酶切)E验证SYBRGreenI和NTC的C₄值EEED标准曲线的相关系数R²E线性动态范围EE整个范围的置信区间DE如果是多通道检测，每个通道反应的效率和检测下限EqPCR分析软件(来源、版本)EC₄值的测定方法EEE参考基因的数量和选择的理由EGB/T42077—2022/ISO20395:2019表E.1MIQE清单[经美国临床化学协会(AACC)许可转载](续)检查项目归一化方法的描述ED技术重复的次数和进度阶段(RT或qPCR)E重复性(批内差异)E复现性(批间差异，%CV)DDE软件(来源、版本)E使用实时PCR数据标记语言(RDML)提交C₄值或原始数据D注：E必要，D可选。E.3dMIQE清单表E.2详细列出了dMIQE指南中公布的基于dPCR的实验结果核对表中的详细的方法学和性能参数。检查项目EEDDEE显微切割还是宏观切割?E处理程序EEE样本存储条件和时间[特别是福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)样品]EEE检查项目DNA/RNA定量E质量/完整性-仪器/方法；例如RIN/RQI和轨迹或3':5’EE模板修饰(酶解、超声、预扩增等)E模板处理(初始加热或化学变性)EERNA样品的DNA污染评估EEDE逆转录(如有必要)cDNA制备方法十浓度EEEEDDD反应体积(两步逆转录反应)DDEDE特异性筛选软件(如BLAST等)EDDD各引物的外显子或内含子位置(如果适用)EE引物序列和/或扩增基因上下游序列EGB/T42077—2022/ISO20395:2019检查项目D探针序列D所有结合位点和修饰信息E引物制造商DDEE引物(探针)、Mg²+、dNTP浓度E聚合酶种类和浓度EED添加剂(SYBRGreenI、DMSO等)EDED质量和体积稀释(手动/自动)DDE单个反应单元体积E测得的反应单元总体积(有效反应大小)ED对照组的详细设计和使用EdPCR仪器生产厂家ED特异性(在测量稀有突变，病原体序列等时)EDE每个反应单元平均拷贝数(λ或等效值)EdPCR分析程序(来源，版本)EGB/T42077—2022/ISO20395:表E.2dMIQE清单[经美国临床化学协会(AACC)许可转载](续)检查项目EE作为补充数据的阳性和阴性实验结果示例E在适当的情况下，证明参考基因的数据和选择理由EED技术重复的次数和阶段(RT或qPCR)E重复性(批内变异)E重现性(批间/用户/实验室等变异)D实验方差或置信区间EED注：E必要，D可选。GB/T42077—2022/ISOguidelines:minimuminformationforpublicationofquantitat2009;55:611-22.[2]KubistaM,AndradeJM,BengtssonM,ForootanA,JonakJ,Linpolymerasechainreaction.MolAspectsMed2006;27:95-125.[3]BarwickVJ,PreparationofCaliLimiteddoi:10.13140/RG.2.2.36338.76488.[4]DubeS,QinJ,RamakrishnanR,Mathematicalanalysisofcopy[5]PfafflMW,AnewmathematicalmodelforrelativequantificationinrcleicAcidsRes2001;2[6]StahlbergA,RusnakovaV,ForootanA,Anderovasingle-celldataanalysis.[7]WhaleAS,HuggettJF,CowenS,SpeirsV,ShcrofluidicdigitalPCRandconventionalquantitativePAcidsRes2012;40:e82.[8]BlandJM,Altman312:1079.[9]CuiX,YuS,TamhaneA,CauseyZL,StegA,DanilaM[10]HuggettJ,DhedaK,BustinS,ZumlaA.;Real-timeRT-PCRnormalisaticonsiderations.GenesImmun2005;6:279-8[11]DevonshireAS,WhaleAS,GutteridgeA,Jonesstandardisationofcell-freeDNAmeasurementinplasma:controlssizebiasandquantification.A[12]VandesompeleJ,DePreterK,PattynF,PoppeB,VanRoyN,DePaepeA,Specuratenormalizationofreal-timequantitativeRT-PCRdatabygeometricaveragiinternalcontrolgenes.GenomeBiol2[13]AndersenCL,JensenJL,OrntoftTF,Normalizatiotion,appliedtobladderandcolonwisecomparisonandstatisticalanalysisofrelatRes2002;30:e36.[15]MestdaghP,VanVlierbeompeleJ.,Anovelanduniversal2009;10:R64.[17]BengtssonM,StahlbergA,RorsmanP,KubistaM,GeneexpreGB/T42077—2022/ISOfromthepancreaticisletsofLangerhansrevealslognormaldistr[18]NixonG,GarsonJA,GrantP,NastouliE,FoyCA,Huggesensitivity,linearitquantificationofhumancytomegalovirus[19]NolanT,HandsRE,OgunkoladeW,BustinSdetectionofinhibitorsinnucleicacidpreparatiotionandQualityStratificationofISBERBiospecimenScienceWorkingGroup.BiopreservBiobank2016;14:398-409[21]RodriguezA,RodriguezM,CordobaJJ,AndradeMJ,Designofprimersaquantitativereal-timePCRmethods.MethodsMolBiol2[22]NolanT,HuggettJ,SanchezPCR(qPCR).doi:10.13140/RG.2.2.15943.96162.[24]www.ncbi.nlm.nih.g[26]LudwigN,BeckerM,SchumannT,recentmiRBaseannotationspotentiallyassociatedformanceParametersandTheirO[28]DevonshireAS,ElaswarapuR,FoyCA,ApplicabilityofRTqPCRassaysandplatforms.BMCG[29]StahlbergA,HakanssonJ,XianX,SembH,KubistaM,PropertiesofthereversescriptionreactioninmRNAquantif[30]SandersR,MasonDJ,FoyCquantification.PloSOne2013;8[31]StahlbergA,KubistaM,PfafflM,Comparisonofreversetranscriptasesingeneexanalysis.ClinChem2004;50[32]FoxBC,DevonshireAS,BaradezMO,MarshallD,FoyCA,Comparisonofreversanalysis.AnalBiochem2012;427:17[33]HuggettJ,NovakT,GarsonJ,GreenC,MorrissusceptibilityofPCRreactionstoinhibitors:animportantandunrecognisedphenomenoNotes2008;1:70.[34]KingC,DebruyneR,KuchM,SchwarzC,overcomePCRinhibitioninancientD[35]StahlbergA,AmanP,RidellB,MfordetectionofB-lymphocytemonoclonalitybycomparisonofkappaandllightchainexpressio[36]SidstedtM,RomsDigitalPolymeraseChainReactionQuantificatDNAPolymerases.AnalChem2017;89GB/T42077—2022/ISOlevel:AnalysisofCNVrevealsthepowerofhighthrou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