(高清版)GBT 42216.3-2022 分子体外诊断检验 福尔马林固定及石蜡包埋组织检验前过程的规范 第3部分：分离DNA

GB/T42216.3—2022/ISO20166-3:2分子体外诊断检验福尔马林固定及第3部分：分离DNA国家标准化管理委员会国家市场监督管理总局发布国家标准化管理委员会 I Ⅱ 12规范性引用文件 1 4 55.1标本采集 55.2运送要求 6 66.1关于标本接收的信息 6.2标本/样品的福尔马林固定 6 76.4冷冻样品的固定 76.5脱钙 86.6处理及石蜡包埋 86.7贮存要求 86.8DNA的分离 8 6.10DNA的贮存 I程的规范第3部分：分离DNA》。Ⅱ 1GB/T42216.3—2022/ISO分子体外诊断检验福尔马林固定及GB/T22576.1—2018医学实验室质量和能力的要求第1部分：通用要求(ISO15189:2012,GB/T27020—2016合格评定各类检验机构的运作要求(ISO/IEC17020:2012,IDT)ISO15189医学实验室质量和能力的要求(Medicallaboratories—RequirementsforqualityISO15190医学实验室安全要求(Medicallaboratories—Requirementsforsafety)2GB/T42216.3—2022/ISO 选术语]质量分数为37%的饱和甲醛水溶液(相当于体积分数40%)。3GB/T42216.3—2022/ISO20166-3:2018定义]标本specimen能力验证proficiencytest本文件中是指18℃~25℃。样品sample标准缓冲福尔马林溶液standardbufferedformalinsolution中性缓冲福尔马林neutralbuffered10%福尔马林(3.9)水溶液，所含甲醛的质量分数为3.7%(相当于体积分数4%),缓冲至pH=贮存storage4GB/T42216.3—2022/ISO20166-3:2018通过提供客观证据对特定的预期用途或应用要求已得到4通则6.2的要求。物分子稳定性和样品贮存条件。应记录不能完全控制的工作流程步骤(如热缺血)与RNA或蛋白质相比，组织中的DNA在热缺血和冷缺血时相对稳定。目前对更长时间的冷缺血和热缺血所造成的DNA序列和拷贝数[如比较基因组杂交(CGH)图谱]的变化尚不清楚[8]。然而，DNA甲基化模式可能会随着缺血时间而改变[6]。宜尽可能缩短将标本置于标准缓冲福尔马林溶液中石蜡包埋组织的贮存或存档以及DNA分离和纯化的方法。使用甲醛作为固定剂时，固定时间和温度解或序列改变[10-15]。这些效应可以限制可扩增DNA靶分子的大小和/或影响用于扩增的引物的靶5GB/T42216.3—2022/ISOd)6.2要求记录的步骤信息(适用于福尔马林固定始于实验室外部),6.3要求记录的步骤信息少DNA降解。6GB/T42216.3—2022/ISO20166-3:2018范围宜按环境温度，室温或2℃~8℃进行大致分类。如果标本尚未放入标准缓冲福尔马林溶液中，宜立即置于冰上或维持温度在2℃~8℃进行即时由于福尔马林不稳定(如甲醛可以氧化为甲酸),宜每周至少检查一次标准缓冲福尔马林溶液的b)记录将组织标本/样品放入标准缓冲福尔马林溶液中的时间点。1)容器的容量宜保证标本可以完全浸没在标准缓冲福尔马林溶液中。标准缓冲福尔马林溶液用量与组织的最小比例取决于相关组织，但宜至少为10:1(体积比)[8]。对于较大的2)使用预先装满标准缓冲福尔马林溶液的容器时，应遵循供应商的产品说明。7GB/T42216.3—2022/ISO20166-3:20183)容器应能安全关闭。1)患者/捐赠者ID、唯一的标本/样品ID和采集样品的日期，这些都能以代码的形式呈现2)基本的标本信息，例如组织类型、组织状态和相关的附加影响信息(如是否受肿瘤影响),除非上述信息在样品追踪系统能够与6.2d)1)使用的标本3)每个容器的唯一编号可包含在6.2d)1)中。宜考虑在某些疾病条件下(如肿瘤),分子特征可能不会均匀地在组织标本/样品中呈现。因此，由具有资质的病理医师对分子检验实际使用的组织标本/样品进行评估是非常重要的(参见6.3)。在这种情况下，宜记录实际上用于分子检验的组织标本/样品的疾病特征(如不同的标本病理学的评估和记录以及从标本中选择用于进一步处理的样品应由具有医师资质的病理医师选择用于DNA检验的样品如下。取合适的标本部分，以确保用于DNA检验的样品采集不会影响组织病理学检验。分子检验取对组织进行(显微)切割以选择或富集疾病的某些细胞特征。病历或临床医师的医嘱),对手术标本和所有发现进行适当的描述。应描述标本解剖学定位，品放入装有酒精溶液(如70%乙醇)的组织处理器中。8GB/T42216.3—2022/ISO20166-3:2018脱钙是根据石蜡的柔软度调整骨骼的坚硬组分，宜用EDTA(乙二胺四乙酸)等脱钙液对其进行脱用于DNA分离的FFPE组织宜新鲜制备。如果切片需要贮存，宜在干燥、冷藏(2℃~8℃)或较低温(一20℃)环境中贮存尽可能短的时间。6.8DNA的分离6.8.1概述当标本/样品用于分子诊断时，在DNA分离前，应将组织对应的切片疾病细胞组成和疾病组织病理特征，并评估目标细胞所占比例。用于检测的组织中目标细胞的数量应福尔马林固定通过添加单羟甲基对DNA进行共价修饰。在第二步中，N-羟甲基在氨基上的亲电a)最佳的固定时长取决于组织类型和厚度。宜避免长时间组织固定造成不可逆转的DNA修9c)宜用平行切片进行苏木精/伊红(H&E)染色，对后续DNA纯化所用的未染色标本进行切割d)对于所有的DNA分离程序宜包括尽可能多地逆转甲醛修饰的措施，避免DNA的进一步e)为避免DNA检测过程中所生成的扩增物质产生交叉污染，除非如果从存档的组织块中分离DNA,则宜在将切片进宜在DNA能力验证计划中对DNA分离程序的性能进行验证评估。使用不同厂家的产品可能会因为不相容而影响结果。只有当各组分共同检测并确认其性能令人满FFPE组织切片的DNA分离程序应包括以下步骤。a)将即刻制备的FFPE组织切片中的石蜡去除。b)将切片重悬于裂解液中，然后用蛋白酶K进行消化以除去交联的蛋白质并且释放DNA。建议对蛋白酶消化步骤和后续加热步骤的裂解缓冲c)在90℃温度下加热孵育1h,除去大部分添加的羟甲基，并逆转交联。GB/T42216.3—2022/ISO20166-3:2018e)从裂解物中分离DNA,例如通过基于苯酚/三氯甲烷的方法或使用商业化试剂盒从FFPE组6.9分离DNA的数量和质量评估a)通过吸光度测量(A₂60)、荧光光谱法或基因组特异d)检测干扰物质的存在(使用添加有DNA质控品的外源性DNA对照，或检查qRCP反应曲线6.10DNA的贮存宜遵循DNA分离试剂盒供应商的具体说明，在检测前保存分离的DNA。如果检测提供者的要求为了长期贮存，DNA宜用弱碱性缓冲液进行洗脱，比如TE缓冲液(含有1mmol/LEDTA和长期贮存的温度宜在-20℃或以下。也可以使用其他经确GB/T42216.3—2022/ISO在分离DNA之前，将每种来源的4个FFPE和肠道(C)组织分离的DNA,用凝胶电泳检测完整性的结果，对每种组织类型和贮存温度进行3次因扩增子，用4种不同的SYBR-Green实时荧光定量PCR,扩增2μL的1:10稀释的DNA洗脱液。GB/T42216.3—2022/ISO图A.2显示了在22℃、4℃、-20℃和-80对来自不同FFPE组织的DNA进行DNA性能分析的结果置于-20℃或-80℃贮存时，通过琼脂糖凝胶电泳可以看到比较高温度贮存GB/T42216.3—2022/ISO[2]GB/T19000—2016质量管理体系基础和术语[4]SN/T2102.1—2008trologicaltraceabilityofvaluesassignedtocalibra[7]ISO/IEC17025,Generalrequirementsforthec[8]HewittS.M.,LewisF.A.,CaoY.etalpathology:issuesconcerningtherecoveryofnucleicacidsfromformalin-fixesue.Arch.Pathol.Lab.Med.2008Dec,132(12)pp.19[9]HeylenL.,ThienpontB.,NaesensM.etal.TheEmergingRoleofDNAMethyneyTransplantation:APerspec[10]WilliamsC.,PontenF.,MobergCAhighfrequemalinfixationofarchivalspecimens.AmJPathol.1999Nov;155(5):1467-71[11]MeSherryG.,KayH.,GallagherD.Formalin-fixedpaspuriouscopynumberchangesinarray-CGHprofiles.Clin.Genet.2007Nov,72(5)pp.441-447[12]TokudaY.,NakamuraT.,SatonakaK.etal.FunDNAdegradationintissuesfixedinformaldehyde.J.Clin.Pathol.1990[13]QuachN.,Goodstrategiesforminimization.Cli[15]ViertlerC.,GroelzD.,GündischS.etal.Anewtechnologyforstabilizationofbisuesforcombinedhistologicalandmolecularanalyses.J.Mol.Diagn.2012S[16]FoxC.H.,JohnsonF.B.,WhitingJ[17]EngelK.B.,&MooreH.M.Effectsofpreanalyticalvariablesonthedetectionobyimmunohistochemistryinformalin-fixed,paraffin-embeddedtissue.Arch.sectedarchivalformalin-fixedandparaffinpp.419-429[19]BurgemeisterRNucleicacidsextractionfromlasermMethodsMolBiol.2011;formalin-fixedcancerbiopsiesbytreatmentwithuracil-DNpp.546-558GB/T42216.3—2022/ISO[21]LaurellH.,IacovoniJ.S.,AbotA.etal.CorrectionofRT-qPCRdarivedsignalswithValidPrime.