GB/T 41622-2022 化学品 大黄蜂急性经口毒性试验（正式版）

国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T41622—2022本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。ⅡGB/T41622—2022本文件描述了一种用于评估农药和其他化学品对成年大黄蜂工蜂急性经口毒性的实验室试验方基础，在2014年由国际植物-授粉生物关系委员会(ICPPR)国际环比试验小组进行首次环比试验，2015年由OECD国际环比试验小组进行第二次环比试验。在环比试验中使用了欧洲熊蜂(Bombus记录。授粉昆虫(如大黄蜂)可通过接触(直接或间接传粉)或食用含有残留植物保护产品或其他化学品的食物而暴露于植物保护产品或其他化学品的残留物。为解决经口暴露于化学物质的潜在风险，可在实验室将成年大黄蜂工蜂暴露于相应的化学物质进行急性经口毒性研究。通过急性经口毒性试验，测定农药及其他化学物质对大黄蜂的固有毒性。应使用本试验的结果判断是逐步评估化学品对授粉昆虫的风险。化学品以活性物质或配制产品的形式进行试验。本方法的目的是测定成年工蜂单次暴露于某种化学品后的LD₅o。试验数据用于适当的授粉生物1GB/T41622—2022化学品大黄蜂急性经口毒性试验本文件适用于评价非挥发性化学品和低挥发性化学品对大黄蜂的急性经口毒性。本文件不适用于高挥发性的化学品。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文GB/T21845化学品水溶解度试验GB/T21855化学品与pH有关的水解作用试验GB/T22052用液体蒸气压力计测定液体的蒸气压力温度关系和初始分解温度的方法GB/T22228工业用化学品固体及液体的蒸气压在10-¹Pa至10⁵Pa范围内的测定静态法GB/T22229工业用化学品固体及液体的蒸气压在10-³Pa至1Pa范围内的测定蒸气压平衡法OECD化学品测试导则No.104蒸气压(VapourPressure)3术语和定义3.13.2受试物的消耗量或使用量。注：以每蜂摄入受试物的质量表示，即pg/蜂。3.3半数致死剂量medianlethaldoseLD₅0单次经口暴露导致50%的受试动物死亡的受试物剂量。3.42GB/T41622—2022b)按照GB/T21845方法测定的水中溶解度；c)受试物在水溶液中的定量分析方法；d)按照GB/T21855方法测定的水解作用；e)按照GB/T22052、GB/T22228、GB/T22229或OECD化学品测试导则No.104方法测定的蒸气压和亨利常数。测定上述参数的温度应在试验报告中予以说明。按不小于预期死亡率50%的剂量，用参比物进行试验，验证受试蜂的敏感性和该试验系统的可靠率不小于50%。也可使用能使受试蜂表现出预期敏感性的其他有毒参比物。6试验原理将成年工蜂暴露于含有受试物的500g/L蔗糖水溶液。试验持续时间至少48h。在对照组死亡率不大于10%时，若至少一个试验组在24h～48h之间死亡率增加不小于10%,应将试验延长至96h。每天记录死亡率并与对照组结果进行比较。对结果进行分析，计算24以及在试验延长后的72h和96h的LD₅o和NOED值。7.1.1采用成年的大黄蜂(Bombusspp.)工蜂。7.1.2收集中等规模，包括各个发育阶段的幼虫和一只产卵期的蜂王、60只～80只工蜂的大黄蜂蜂群用于试验。自蜂群到达实验室之日起一周内使用蜂群进行试验。7.2试验笼具7.2.1每只大黄蜂在一个独立的笼中单独喂养，防止(没有蜂王的工蜂之间)互相攻击引起死亡，并可的材料制造的笼具。试验笼具的大小应与受试蜂的体型相适应(最小为15cm³)。更多信息见附录A。7.3.1在转移到试验笼之前，在红光下(不麻醉)或通过急速冷冻，从蜂群采集成年大黄蜂工蜂。只使用那些在未去除棉层(如果存在)的蜂群中采集的成年大黄蜂工蜂(详情见附录A)。通过目视检查，去除体型非常小和特别大的工蜂。幼蜂(可通过灰色3GB/T41622—20227.4处理和饲喂可在红色光或灯光下进行包括试验处理和观察在内的试验操作。将蔗糖溶于水中制备最终浓度为500g/L的饲喂溶液(例如500g/L的蔗糖水溶液),使用适当的饲喂器(饲喂器可采用剪掉尖端的市售容积2mL的塑料注射器),饲喂所有受试蜂。在暴露阶段，受试蜂喂食含有受试物或参比物的饲喂溶7.5受试蜂的准备7.5.1受试蜂应在试验条件下(包括单笼饲养)至少驯养8h,自由饮用未加受试物的500g/L的蔗糖工蜂的数量应超过试验所需受试蜂的数量。宜多准备5%的受试蜂和笼具。应额外考虑对非摄食蜂的7.5.2为确保受试蜂在4h内摄入含有受试物的饲喂溶液，受试蜂在暴露前禁食2h～4h。7.6试验溶液准备7.6.1将受试物贮备液或受试物与500g/L的蔗糖水溶液混合。对水溶性好的受试物，用水溶解。对度不应超过5%(体积分数)。只要符合溶剂对照组的有效性要求，也可使用任何其他溶剂、增溶剂或增7.6.2通过稀释贮备液或高浓度溶液来准备最终饲喂溶液，即5007.6.3如果使用溶剂、增溶剂、分散剂等来溶解受试物，应制备适当的溶剂对照组溶液。在这种情况7.7受试物分析验证放在-18℃以下冷冻保存，用于分析受试物实际浓度。如果使用贮备溶液制备饲喂溶液，额外取一份7.7.2如果试验期间使用不同批次的受试物，应从每一批次受试物的溶液中分别取出一份最低浓度和8试验程序8.1.1应先进行预试验，确定正式试验的浓度范围，以选择适当的剂量值。试验浓度以及平行数的设置应满足LDs₀及其95%置信限计算的统计学要求。通常按等比设置5个试验浓度，等比系数结果分析时所选用的统计学方法。8.1.2每个浓度的受试物处理组至少设30个平行(笼),每个平行(笼)中1只受试蜂。对于毒性较低的受试物，可用50个平行(笼)的空白对照组和受试物处理组、至少30个平行(笼)的毒性参比物对照组进行限度试验。4GB/T41622—20228.2使用溶剂时的对照组如果试验中使用溶剂，应设置2个对照组：水空白对照组和溶剂对照组。检验水空白对照组的统计学显著性差异。如果没有显著性差异，可将这两个对照组一并进行进一步的统计学评价。如果存在统计学的差异，溶剂对照组结果用于计算LD₅和校正受试物处理组的死亡率。8.3暴露(饲喂)8.3.1为每只受试蜂提供40μL含有适当剂量受试物的500g/L蔗糖水溶液。如果有足够证据证明合为装有不含受试物的500g/L蔗糖水溶液的饲喂器。暴露时间不应超过4h。然后提供未处理的8.3.2对于某些化学品，在较高剂量下，受试蜂拒食受试物可能导致摄食量很少甚至没有。最长4h期内，消耗量小于各处理组平均消耗量的80%的特殊受试蜂。由于摄食量有限，“非摄食蜂”尚未充分果剔除不相关的低摄食数据点，应在10.2试验报告中说明。数据记录。非摄食蜂的数据应在数据记录中进行标记，并在终点计算时排除这些数据。特殊情况下(例8.3.5为了弥补每个受试物处理组中的非摄食蜂缺失的数据点，每组宜使用超过30只受试蜂，并使用摄食蜂替换非摄食蜂。试验过程中，受试蜂应放在避光、稳定、可控的人工气候条件下，温度25℃±2℃,相对湿度(60±20)%。试验过程中还应采用合适的且经过校准的设备持续记录这些试验条件。短期(2h以内)8.5试验时间受试蜂对受试物暴露后，至少观察48h。在对照组的死亡率保持在不大于10%的可接受水平时，若至少一个受试物处理组24h～48h之间死亡率增加大于10%,则应延长试验时间，最长至96h。8.6观察和测量72h和96h后进行进一步评估。a)未受影响的：受试蜂未表现出异常行为(包括自然的静止状态);5GB/T41622—20228.7.1在预计受试物毒性较低的情况下，可进行限度试验(如有效成分剂量采用100pg/蜂),以确定LDso是否大于该剂量值。试验程序如8.1～8.6所述(包括相关的空白对照组和毒性参比物对照组的使用),但除毒性参比物对照组至少采用30个平行外，每个受试物处理组采用50个平行来代替30个平行。9质量保证与质量控制a)只有500g/L蔗糖水溶液的空白对照组受试蜂的死亡率不大于10%;溶剂对照组(如有)受试蜂的死亡率不大于10%;b)毒性参比物对照组受试蜂的死亡率不小于50%。用的受试蜂数量、每个观察时间点的死亡率和表现出亚致死效应的受试蜂数量。采用适当的统计学方每一观察时间点(即24h、48h,以及72h、96h)的剂量反应曲线图，计算曲线斜率及其95%置信限的半数致死剂量(LDso)。可使用标准程序(如Abbott校正法)校正对照组死亡率。试验终点(LDso)以单只试验报告应包括以下内容。a)受试物和参比物：●单一组分的物质：物理状态、水溶解性及相关的物理化学性质；化学标识，如IUPAC名称●来源、批次和/或批号(如有);●受试物在水或溶剂中的溶解度(如有);b)试验系统：6GB/T41622—2022●试验设计的描述：处理组(包括对照组和参比物对照组)的数量、每个处理组的平行个数、受试物的试验剂量；●试验操作和评价期间的光源；●试验溶液的体积和受试物处理所用的时间；●试验的时间和地点。d)试验结果：●试验结束时的剂量反应曲线图(若适用);●在每一观察时间点的受试物LD₅。值(95%置信限);●NOED值(如果能得到);●得到LD₅。值和NOED值的统计方法；●观察到的亚致死效应；●对本文件的偏离情况及其他相关信息。7GB/T41622—2022(资料性)A.1试验笼具试验期间，每只受试蜂应放置在独立的笼具中。宜使用带有2mL塑料注射器(剪掉尖端，扩大受试蜂的取食开口)的蜂王育种系统(见图A.1~1——剪掉尖端的2mL塑料注射器(饲喂源);流向注射器的开口端(特别是在自由进食期间)。注射器用中间钻一个孔的橡胶塞固定。为受试蜂自由进食，1——2mL塑料注射器(饲喂源);8GB/T41622—2022图A.3多个笼具设置示意图A.2试验时间的选择参与环比试验实验室的经验表明，冬季的大黄蜂摄食和死亡率波动较大。所以，为了得到更可靠、复现性更高的试验结果，只在每年的3月至10月间开展试验。A.3关于大黄蜂采集和随机分组的补充宜使用有棉层覆盖的大黄蜂。经验表明，工蜂是在棉层顶部蠕动爬行的第一群，幼虫和雄蜂在巢中。这样方便