分化细胞中多能干细胞残留TaqMan探针实时荧光定量PCR法检测通则

中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,GB/T42077生物技术核酸靶序列定量方法的性能评价要求用于检测的分化细胞。多能干细胞残留检测宜按照对于微量或痕量靶标检测的基本原则进行方法注1：对于残留检测，所提取核酸样本的完整性是影响方法检出限注2：如所提取的样本的细胞数量超出了提取方法的提取细胞量的适用范围3）开发方法时应对RNA提取方法的性能进行评估，可检测，或加标定量PCR方法评价RNA提取方法的性能，程中宜包含去除基因组DNA的操作步骤，如使用DNA结合柱，DNA酶处理等方分别读取260nm和280nm处的吸光度(OD260和OD280)，RNA的纯度以（1）当未稀释的cDNA内参检测基因的ct值在定量线性范围内时，无需对cDNA2）如须进行中间样本保存，保存的条件与效期应通过在多能干细胞残留检测限条件下的验证。不同中间样本推荐的保存条件与基于多能干细胞与其分化产生的供试品细胞之间的表达水平差异选择在多选择在多种分化细胞中都显示阴性表达结果的基因.9.1.2可通过多能干细胞与其分化获得的供试细胞的高通量基因表达组学分析来1）宜使用与与供试品细胞同等类型的成体原代分离细胞做为质控品细3）在质控品细胞或供试品细胞中不表达，qPCR检测结果为未检出（无如选择的靶标基因在供试品细胞中扩增Ct值≧35，且稳定检出特异扩增曲线，宜通过不同批次的细胞的检测实验确立供试品细胞基础Ct值（Ct生产批次的供试品细胞中靶标基因的定量表达，根据检测结果确立Ctbasal，检测过程宜符合GB/T42077中的技术要求。如Ctbasal<352）在多能干细胞中稳定表达，在多能干细胞qPCR检测结果为阳性，且3）在早期分化的细胞中（如EB阶段）阳性表达，在早期分化的细胞中，（a：如靶基因在供试品qPCR检测结果为未检出（无典型扩增曲线），选取b:如选择的靶标基因在供试品细胞中扩增Ct值≧35,且检出限加标样本与量的不同代表性分化结点细胞样本，进行同样方法的扩增核酸制备，在固定的9.3.1应分别针对靶标基因和内参基因mRNA序列设计引物和探针序列，且设计注：荧光基团的波长范围呈正态分布的，有一定的带信号会有一定的交集，因此，在同时选择多个荧光基10.1可选择一步法扩增反应或两步法扩增反应对供试品RNA残留进行检测，应于20ul/管。供试品模板量宜按照最大量添加，每个测2）根据不同型号实时荧光PCR仪和所选扩增试剂的使用12.2.1阴性结果：靶标基因无Ct值，无特异性的扩增曲线，判定该样品靶标基因仍Ct值≥Ctbasal，判定为阴性，多能干细胞残留量在检出限以下。如Ct值<Ctbasal,——特异性——精密度——检出限——正确度——稳健性13.2应在检测过程中充分考虑可能影响结果评定或造成检出限漂移的因素，包——供试品细胞类型——检测引物探针的浓度、来源、探针的荧光标记——扩增试剂的组分——定量PCR检测仪器及其参数设定当上述因素发生变更时，应按照GB/T40277中的内容对检测方法进行再次验证。待评价方法进行RNA提取，每种提取方法设定至少6个平行样本，提取获得的样本准备：按实验需求取足够数量的供试品细胞样成适合浓度（Concells）的细胞悬液，按实OD260/OD280值，OD260/按下述公式计算提取不纯提取概率Pnp百分比:18S条带亮度的两倍；若能看见三条带，但带型模糊或弥散，则说明RNA有部在一定数量的供试品细胞中定量加入含有供试品中样本准备：按实验需求取足够数量的供试品细胞样管中，离心去上清后获得细胞沉淀平行样本，在参考品中靶标序列进行检测，每个样本至少设置三个检样本准备：按实验需求取足够数量的供试品细胞样参考品中靶标序列进行检测，样品靶标使用体系最大加样产量评价：在参考品的扩增阳性的前提下，样本靶标本，选定适宜检测靶标（在细胞样本中稳定阳），在检出限条件下制备平行待检测试中间样本（如细），组样本进行后续检测，组内检出限样本结果均判定为阳次通过细胞计算制备成适合浓度的细胞悬液，按按照实验需求平行准备足够数量供试品样品、冻存于-80℃冰箱，分别在所设计的时间点取出进行检测结果满足以下条件的实验组判定为通过验1）实验组中所有供试品样品判2）实验组中所有的检出限样本3）实验组中所有的阳性对照样至少设计3个平行样。其中取一组样本立即进行后续检测，其余样本按实验设计方案保存于2-8℃冰和阳性对照样本，在同一次试验中，完成所有样本RNA行等量分装，分别按照2-8℃保存梯度时间点(如立即检至少设计3个平行样。其中取一组样本立即进行后续检测，其余样本按实验设计方案保存于2-8℃冰测，其余样本按实验设计方案保存于2-8℃冰箱romhumanpluripotentstemcells，Reg 心肌细胞、肝细心肌细胞，巨噬多巴胺能神经前 视网膜色素上皮胞心 TD