TCAOE 74-2024 海洋贝类片形科吸虫PCR检测方法

ICS65.020.30ICS65.020.30CCSB41CAOET/CAOE74—2024海洋贝类片形科吸虫PCR检测方法PCRmethodeforthedetectionofProsostomatatrematodeinmarinemollusk2024-02-04发布 2024-02-04实施中国海洋工程咨询协会 发布T/CAOE74T/CAOE74—2024PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANII目 次前 言 II范围 1规范性引用文件 1术语和定义 1缩略语 1试剂 1仪器与设备 2样品 2检测方法和阳性结果确认 3结果判断及表述 3安全 3防污染措施 3附录 4前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规起草。本文件由鲁东大学提出。本文件由中国海洋工程咨询协会归口。本文件起草单位：鲁东大学、中国水产科学研究院长岛增殖实验站。本文件主要起草人：王晓通、刘雅琼、魏磊、蔡忠强、王晓娜、房燕、李明珠。T/CAOE74T/CAOE74—2024PAGEPAGE1海洋贝类片形科吸虫PCR检测方法范围本文件规定了海洋贝类片形科吸虫的普通PCR检测方法，包括试剂、仪器与设备、样品、检测方法和阳性结果确认、结果判断及表述等内容。本文件适用于海洋贝类中寄生的片形科吸虫的检测，包括肝片吸虫（Fasciolahepatica）和大片吸虫（F.gigantica）等。规范性引用文件（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489-2008实验室生物安全通用要求SN/T1193基因分析检测实验室技术要求SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。缩略语下列缩略语适用于本文件。TAE：Tris、乙酸（Aceticacid）和EDTA组成的缓冲液ITS：内部间隔序列（Internaltranscribedspacer）EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid）SDS：十二烷基磺酸钠（Sodiumdodecylsulfate）TE：Tris盐酸和EDTA缓冲液（EDTATris-HCl）EB：溴化乙锭（Ethidiumbromide）PCR：聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction）Tris：三羟甲基氨基甲烷（Trishydroxymethylaminomethane）试剂水：符合GB/T6682中规定的一级水。50×TAE电泳缓冲液：按附录A.1配制。异丙醇：分析纯。氯仿/异戊醇混合液（241）：分析纯。酚/氯仿/异戊醇混合液（25241）：分析纯。无水乙醇：分析纯。70%乙醇：按附录A.2配制。检测引物ITS-F（10μmol/L）：5’-TGTCCGAGGGTCGGCTTATAAAC-3’，-20℃保存。ITS-R（10μmol/L）：5’-CACGAGGGTGCCGTCGTTATAT-3’，-20℃吸虫中380bp片段。DNA分子质量标准溶液：生化试剂。10×上样缓冲液：按附录A.3配制，或其它等效产品。PCR检测阳性对照为已知受片形科吸虫感染的贝类组织样品或添加片形科吸虫保守序列标准品质粒的贝类组织样品，PCR检测结果为阳性，-80℃保存。PCR检测阴性对照为已知未受片形科吸虫感染的贝类组织样品，-80℃保存。EB（10μg/μL）：按附录A.4配制，或其它等效产品。10%SDS：按附录A.5配制。TE缓冲液：按附录A.6配制。裂解缓冲液：按附录A.7配制。蛋白酶K：生化试剂。3mol/LNaAc（pH5.0）：按附录A.8配制，或其它等效产品。2×PremixTaqDNA聚合酶：生化试剂，-20℃保存。仪 与设备PCR（10℃~（200rpm~2500V~300V）、微量移液器（0.1μL~2.5μL，0.5μL~10μL，10μL~100μL，20μL~200μL，100μL~1000μL规格（1μL，1000μL规格2mL1.5mL200μLPCR（0.001（最高转速不小于12000rpm）。样品样品选取在海洋贝类产地或水产市场，按照SC/T7103规范执行贝类样品的采集。样品运输和前处理贝类活体样品应在4℃100mg2mL冻存管中，液氮冷冻。液氮中运输。组织样品若暂时不能检测应用液氮冷冻，保存于-80℃冰箱中。样品DNA提取步骤电子天平称取新鲜或冷冻样品的匀浆组织0.05g，转移至1.5mL离心管。加入450μL裂解缓冲液。加入50μL10%2.5μL蛋白酶K（20100μg/mL，混匀后置于55℃水浴4h～6h，每2h颠倒离心管6～8次摇匀，至体系透亮为好。室温12000rpm离心20min，取上清至新的1.5mL离心管。加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液（25:24:1），缓慢颠倒混匀5min，12000rpm离心10min，取上层清液至新的1.5mL离心管。加入等体积氯仿/异戊醇混合液（241），缓慢颠倒混匀5min，12000rpm离心10min，取上层清液至新的1.5mL离心管。加入1/10体积3mol/L的NaAc（pH5.0，4℃保存）和等体积-20℃预冷的无水乙醇，置于-20℃淀DNA30min，12000rpm离心5min，弃去上清。加入100μL～150μL-20℃预冷的70%乙醇洗涤，12000rpm离心5min，小心弃去乙醇，用70%乙醇重复洗涤一次，弃去乙醇。置于烘箱中45℃干燥15min～30min，加入适量TE缓冲液溶解DNA（TE量视DNA在30μL～100μL50μL），-20℃保存备用。可采用同等抽提效果的其他方法或等效商品化DNA提取试剂盒。检测方法和阳性结果确认PCR反应方法PCR反应体系按照表1的要求配置，同时设置空白对照、阴性对照和阳性对照。表1 PCR反应所需试剂及组成试剂20μL体系试剂终浓度2×PermixTaqDNA聚合酶10μL1×检测引物ITS-F（10μmol/L）2μL1μmol/L检测引物ITS-R（10μmol/L）2μL1μmol/L样品DNA50～100ng灭菌双蒸水补至20μL—按照体系将相应酶、引物、DNA模板以及无菌水加入PCR管中。使用PCR仪按照以下反应程序预变性3min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸30sec，35伸5min；4℃保温。琼脂糖凝胶电泳检测方法40mL1.5%琼脂糖凝胶（A.9配制。凝胶冷却后放入电泳槽内，在电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。9μLPCR1μL10DNA分子量标准对照。120V20min。将凝胶置于凝胶成像仪下观察电泳结果。结果成立条件空白对照和阴性对照380bp位置无目的条带，且阳性对照出现380bp位置的明亮条带。结果判断及表述380bp380bp感染阴性。安全实验室安全防护按GB/T19489中的规定执行。防污染措施检测过程中防污染措施按照SN/T1193的规定执行。附录附 录 A（规范性）试剂配方缓冲液：0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠）溶液，pH8.0H2O 186.1g灭菌去离子水 800mL5mol/L氢氧化钠溶液调pH至8.0，灭菌去离子水加至1000mL，121℃，15min灭菌备用。电泳缓冲液（50×）242g冰乙酸 57.1mL0.5mol/L溶液，pH8.0 100mL灭菌去离子水加至1000mL，121℃，15min灭菌备用。用时用灭菌去离子水稀释至1×使用。A.2 70%乙醇无水乙醇7mL灭菌去离子水3mL现用现配。A.3 10×上样缓冲液聚蔗糖25g灭菌去离子水100mL溴酚蓝0.1g可采用等效商品化产品。A.4 EB（10μg/μL）溴化乙锭20mg灭菌去离子水2mLA.5 10SDS的配置SDS10g灭菌去离子水定容至100mLTE缓冲液1MTris-HCl，pH8.0碱 6.06gddH2O 40mLCl（.1LpH8.050L。0.5MEDTA-Na2·2H2O 9.306gddH2O 35mL剧烈搅拌后用NaOH颗粒（约1g）调pH至8.0，定容至50mL。TE缓冲液1MTris-HCl（pH8.0） 10.5M8.0） 0.2ddH2O100mL裂解缓冲液1MTris-HCl（pH8.0） 10.5MEDTA（pH8.0） 20mLNaCl