药物分析-药物常见定量分析方法（药物分析课件）

药品含量测定之光谱法紫外-可见分光光度法1.概念紫外可见光区为200到760纳米，是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。2.特点灵敏度高，准确好，选择性较好，操作简单快捷。可用于药物的鉴别检查和含量测定，应用非常广泛。具有芳香环或者是共轭双键结构的化合物均对光具有吸收度。适用范围在可见光区，很多物质本身没有吸收，但可在一定的条件下加入显色剂，或者是经过处理，使其显色后再测定，因此，紫外可见分光光度方法适合于这类药物的鉴别，纯度检查和含量测定。紫外-可见分光光度法3.基本原理（1）单色光辐射穿过被测物质溶液时，在一定的浓度范围内被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，朗伯-比尔定律如下：紫外-可见分光光度法式中A为吸光度；E为百分吸收系数，其物理意义为当溶液浓度为1%（g/ml），液层厚度为1cm时的吸光度数值；C为100ml溶液中所含物质的重量，L为液层厚度cm。紫外-可见分光光度法对照品比较法AC比色法BD标准曲线法

百分吸收系数法4.含量测定紫外-可见分光光度法4.含量测定分别配制供试品溶液和对照品溶液，在规定的波长处测定供试品溶液和对照品溶液的吸光度Ax和AR后，按下式计算供试品中被测溶液的浓度Cx（1）对照品比较法百分含量%计算公式为：紫外-可见分光光度法标示量

%

等于百分含量乘以平均片重再除以标示量。原料药的含量百分比等于被测药的浓度乘以原始体积乘以稀释倍数D，除以取样量，W是药物的取样量。4.含量测定紫外-可见分光光度法

式中：Cx：供试品溶液的浓度Ax：供试品溶液的吸光度CR：对照品溶液的浓度AR：对照品溶液的吸光度V：原始体积

W：供试品取样量紫外-可见分光光度法4.含量测定例1：对照品比较法盐酸氯丙嗪片剂的含量测定：取本品20片，精密称定为8.100g，研细精密称取0.4800g片粉，置于500ml量瓶中，加酸及水溶解并稀释至刻度，取上清液5.00ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，在254nm测得吸收度为0.540，另取盐酸氯丙嗪对照品，配成6.0μg/ml的对照品溶液，同法在254nm处测的吸收度为0.564，标示量为50mg/片，计算标示量百分数。紫外-可见分光光度法4.含量测定已知：AX=0.540AR=0.564CR=6.0μg/mlD=100/5W取=0.4800g平均片重=8.100/20紫外-可见分光光度法4.含量测定按各品种项下的方法配制供试品溶液，在规定的波长处测定其吸光度，再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。用本法测定时，吸收系数通常应大于100，并注意仪器的校正和检定。（2）百分吸收系数法根据朗伯-比尔定律：得出：△C浓度是百分浓度，所以乘以一百分之一制剂是片剂的计算公式如下：△V是原始体积，D是稀释倍数紫外-可见分光光度法制剂是注射剂的计算公式如下：紫外-可见分光光度法4.含量测定例2：对乙酰氨基酚原料药含量测定：精密称取对乙酰氨基酚0.0411g，置250ml量瓶中，加0.4%氢氧化钠溶液50ml，加水至刻度，摇匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加0.4%氢氧化钠溶液10ml，加水至刻度，摇匀。依照分光光度法，在257nm波长处测得吸收度为0.582。按C8H9NO2的百分吸收系数为719计算对乙酰氨基酚的百分含量。紫外-可见分光光度法4.含量测定已知：A=0.582E=719V原始=250ml

D=100/5W取=0.0411g紫外-可见分光光度法4.含量测定例3：维生素B1注射液含量的测定：精密量取本品（规格2ml：50mg）2ml，置200ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加盐酸溶液（9→1000）稀释至刻度，照紫外-可见分光光度法（附录ⅣA），在246nm的波长处测得吸光度为0.521，按维生素B1的吸收系数（）为421，计算本品相当于标示量的百分含量。紫外-可见分光光度法4.含量测定已知：A=0.521

E=421

V原始=2ml

D=200/2×100/5W取=0.0411g

标示量为：50mg每支容量=2ml紫外-可见分光光度法指供试品本身在紫外可见光区没有吸收或在紫外光区虽然有吸收，为了避免干扰或者是提高灵敏度，可加入适当的显色剂，显色后测定。紫外-可见分光光度法（3）比色法4.含量测定以吸光度与相应的浓度绘制成标准曲线后再根据供试品的吸光度，在标准曲线上查得其相应的浓度，并求出其含量。紫外-可见分光光度法（4）标准曲线方法药品含量测定之容量分析法药品剂量太小，达不到有效的血药浓度，起不到治疗作用，剂量过大，则容易引起中毒反应，有些药品因所治疾病不同，剂量也会有很大差异。概述解热镇痛每次0.3～0.6g治疗风湿性关节炎每次0.6～1.0g预防心肌梗死每次0.05～0.1g

阿司匹林剂量不同用途不同基于生物学原理——“效价测定”药物定量分析1.概念药物定量分析是指运用物理、化学或生物化学的方法和技术，测定药品中有效成分或指标性成分的含量，它是评价药品质量、判断药物优劣的重要手段。2.分类基于物理或化学原理——“含量测定”药物定量分析方法化学分析法仪器分析法药物定量分析重量分析法容量分析法电化学分析法色谱法分光光度法1.名称

原理：将一种已知准确浓度的滴定液滴加至待测物质的溶液中，直到化学反应完全作用为止，然后根据所用滴定液的浓度和体积计算出待测物质含量的分析方法，又称“滴定分析法”。容量分析方法广泛应用于化学原料药的含量测定。容量分析法2.特点优点方法简便易行：仪器设备简单、易于操作、成本低、速度较快。方法耐用性高：影响条件与环境因素较少。测定结果准确：相对误差在0.2%以下。缺点方法专属性差：对结构相近的有关物质或其他干扰杂质缺乏选择性，故一般适用于主成分含量较高的试样的分析。△原料药纯度达到98.5%以上时首选容量分析法。容量分析法3.分类酸碱滴定法氧化还原滴定法配位滴定法非水溶液滴定法亚硝酸钠滴定分析法容量分析法1.概念（2）校正因子每1ml规定浓度的滴定液所相当的被测药物的质量，用T（mg/ml）来表示：被测物WA=T×VB（1）滴定度校正因子等于滴定液的实际浓度与滴定液的规定浓度之比，而实际的滴定度等于药典规定的滴定度乘以校正因子。容量分析法容量分析法的有关计算2.原料含量△原料：百分含量，即测得量与取样量之比V：消耗滴定液的体积（ml）T：滴定度（mg/ml）F：滴定液的浓度校正因数W：称样量（mg）F=滴定液实际标定的浓度/规定的浓度（1）直接滴定法

2.原料含料精密称取本品0.4018g，加中性乙醇20ml溶解后，加3滴酚酞指示剂，用NaOH滴定液（0.1002mol/L）滴定至粉红色，消耗体积为22.20ml，求阿司匹林的含量？（ch.p每1ml0.1mol/L的NaOH滴定液相当于18.02mg的阿司匹林）例1：阿司匹林的含量测定解题思路：已知取样量W=0.4018gV=22.20mlT=18.02mg容量分析法的有关计算

=99.80%△公式的上下单位一定要统一容量分析法的有关计算制剂含量：标示量的百分含量。就是每片/每支实际测得量与标示量之比。标示量也是药品的规格。容量分析法的有关计算3.制剂含量公式中的

W表示平均片中，前半部分是百分含量，百分含量乘以平均片中得的是每片中药物的实际含量，再除以标示量，得到标示量%。（2）制剂直接滴定法测定含量计算公式：容量分析法的有关计算3.制剂含量例2：甲苯磺丁脲片剂的含量测定（标示量0.5g/每片）取甲苯磺丁脲10片，精密称定为5.9480g，研细，精密称取片粉0.5996g，加中性乙醇25ml，微热，使其溶解，放冷，加酚酞指示剂3滴，用氢氧化钠滴定液（0.1008mol/L）滴定至粉红色，消耗量18.47ml。每1ml氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）相当于27.04mg的甲苯磺丁脲。试计算本品的标示量百分含量，并判断是否符合规定。容量分析法的有关计算3.制剂含量直接滴定法→片剂→公式已知：V→18.47mlT→27.04×10-3g/ml平均片重→5.9480/10=0.5948g容量分析法的有关计算3.制剂含量例3：盐酸普鲁卡因注射剂（规格1ml∶50mg）含量测定精密量取盐酸普鲁卡因注射液2ml，加水40ml，盐酸溶液（1→2）15ml，溴化钾2克，照永停滴定法，用亚硝酸钠滴定液（0.1032mol/L）滴定，消耗亚硝酸钠滴定液（0.1032mol/L）体积3.50ml。每1ml亚硝酸钠滴定液（0.1mol/L）相当于27.18mg的C13H2lN30·HCI。求本品的百分含量。

容量分析法的有关计算3.制剂含量消耗滴定液的体积V=3.5ml，T=27.18mg，V取=2ml。

规格1ml∶50mg是每支容量为1ml，标示量为50mg。容量分析法的有关计算容量分析法的有关计算药品含量测定之色谱法色谱分析方法概念将混合物当中各组分分离后在线或者是离线分析的一种分析方法，具有灵敏度高，选择性高，分析速度快，应用范围广等特点，是复方制剂含量测定的首选方法。高效液相色谱方法气相色谱方法离子色谱方法凝胶色谱方法1.基本原理采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由色谱工作站记录和处理色谱信号。一、高效液相色谱法高效液相色谱法是分析混合物最有利的手段。广泛应用于药物制剂的含量测定，尤其是复方制剂、中成药及抗生素类药的含量测定的首选方法。一、高效液相色谱法高效液相色谱法根据固定相与流动相极性的相对强弱，分为正相色谱和反相色谱。流动相极性大于固定相极性称为反相色谱，反之，为正相色谱。一、高效液相色谱法2.高效液相色谱仪常用的色谱柱填充剂有常用十八烷基硅烷键合硅胶（C18）、离子交换填充剂、凝胶或高分子多微球填充剂，十八烷基硅烷键合硅胶（C18）最为常用。检测器检测器有紫外检测器，有二极管阵列检测器，荧光检测器，示差折光检测器，蒸发光散射检测器，电化学检测器和质谱检测器等等，最常用的是紫外检测器。△高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据处理系统组成。色谱柱一、高效液相色谱法流动相流动相使用前应采用0.45μm滤膜滤过并经脱气处理，流动相中应尽可能不用缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般不低5%。反相色谱系统常用流动相首选甲醇-水系统；采用紫外末端波长检测时，首选乙腈-水系统。色谱柱保存时应保持填料在湿润状态，两端密塞，如C18柱可在甲醇中保存。2.高效液相色谱仪一、高效液相色谱法以上三个条件是不能随意改变的。如色谱柱内径与长度、填充剂粒径、流动相流速、混合流动相各组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等均可适当改变。一、高效液相色谱法理论塔板数分离度灵敏度拖尾因子重复性高效液相色谱仪系统适用性试验一、高效液相色谱法用于评价色谱柱的分离效能。由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量色谱柱效能的指标时，应指明测定物质，一般为待测物质或内标物质的理论板数。（1）色谱柱的理论板数（n）2.高效液相色谱仪一、高效液相色谱法色谱柱的理论板数越多，柱效越高。一、高效液相色谱法在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分色谱峰或内标物质色谱峰的保留时间

tR

和峰宽（W）或半高峰宽（Wh/2），计算色谱柱的理论板数：用于评价待测物质与被分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统分离效能的关键指标。除另有规定外，待测物质色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度应大于1.5。（2）分离度（R)2.高效液相色谱仪一、高效液相色谱法（3）灵敏度用于评价色谱系统检测微量物质的能力，通常以信噪比（S/N）来表示。定量测定时，信噪比应不小于10；定性测定时，信噪比应不小于3。一、高效液相色谱法2.高效液相色谱仪用于评价连续进样中，色谱系统响应值的重复性能。（4）重复性（R)采用外标法时，取对照溶液，连续进样5次，峰面积RSD应≤2.0%；采用内标法时，配制相当于80%、100%、120%的对照液，加入规定的内标，分别进样3次，计算平均校正因子，RSD亦应≤2.0%。一、高效液相色谱法用于评价色谱峰的对称性，除另有规定外，拖尾因子T值应在0.95～1.05之间。（5）拖尾因子(T)2.高效液相色谱仪一、高效液相色谱法高效液相色谱法进行药物含量测定有两种方法：外标法和内标法一、高效液相色谱法供试品→供试品溶液对照品→对照品溶液进样，测量对照品溶液和供试品溶液中待测物质的峰面积（或峰高）。（1）外标法缺点：不易精确控制进样量，宜选用定量环或自动进样。3.测定法一、高效液相色谱法取对照品和内标物质，分别配成溶液，各精密量取适量，混合配成对照溶液。取一定量进样，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高。（2）内标法AS为内标物质的峰面积或峰高；AR为对照品的峰面积或峰高；CS为内标物质的度；CR为对照品的浓度。3.测定法一、高效液相色谱法供试品+内标→供试品溶液，进样，测定供试品和内标物质的峰面积或峰高，计算含量。（2）内标法3.测定法采用内标法，可避免因供试品前处理及进样体积误差对测定结果的影响。一、高效液相色谱法3.测定法例1：外标法测定盐酸环丙沙星原料药的百分含量供试品的测定：精密称取本品51.24mg，放置到100ml容量瓶中加流动相稀释至刻度，摇匀；精密取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，样品峰面积为13004；对照品的测定：另精密称取盐酸环丙沙星对照品51.07mg，同法测定，记录峰面积为14325。一、高效液相色谱法一、高效液相色谱法二、气相色谱法1.概念采用气体为流动相（载气）流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。物质或其衍生物气化后，被载气带入色谱柱进行分离，各组分先后进入检测器。用数据处理系统记录色谱信号。气相色谱法主要用于用于溶剂残留量的检查、乙醇测定、挥发性杂质检查或者本身具挥发性，加热气化的供试品的测定。二、气相色谱法应用2.特点许多样品难以气化，操作较繁杂，没有高效液相色谱法应用广泛。分离度高，灵敏度好。缺点优点气相色谱法二、气相色谱法药物分析中主要应用于原料当中，残留溶剂和挥发性杂质的检查，以及因含杂质干扰有具有一定挥发性的药品的含量测定。色谱柱3.仪器要求二、气相色谱法载气源（流动相）常用载气有氮气、氦气和氢气，最为常用载气为氮气。为填充柱或毛细管柱。色谱联用技术及其应用质谱法（MS）是在离子源中将分子解离成气态离子，测定生成离子的质量和强度（质谱），进行定性和定量分析的常用谱学分析方法。概述（一）液相色谱-质谱联用技术1.概念高效液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）将高分离能力、使用范围极广的液相色谱分离技术与高灵敏、高专属的质谱技术结合起来，成为一种强有力、多用途的定性、定量分析工具。（一）液相色谱-质谱联用技术2.应用药物（包括生物大分子）结构信息的获取、分子质量的确定药物质量控制（药物杂质、异构体、抗生素组分的分析）药物的体内过程分析、药物代谢产物研究ABCF（一）液相色谱-质谱联用技术2.应用临床血药浓度检测代谢组学蛋白组学高通量药物筛选研究DE（一）液相色谱-质谱联用技术3.组成高效液相色谱-质谱联用仪器由高效液相色谱系统（进样系统）、色谱-质谱接口（离子源和真空接口）、质量分析器等部分组成。这些离子经真空接口进入质量分析器，按质荷比（m/z）分离经进样系统引入的待测化合物，在离子源中生成气态正离子（或负离子）获得待测化合物的质谱图（一）液相色谱-质谱联用技术离子检测器检测检测信号经转换计算机系统处理若待测样品经色谱分离后，被部分或全部的依次引入离子源时，将获得该待测样品的色谱图。（一）液相色谱-质谱联用技术外标法和内标法是质谱常用的定量方法，内标法具有更高的准确度。质谱法可实现高专属性、高灵敏度的定量分析。定量分析采用选择离子检测或选择反应检测、多反应检测等方式，通过测定某一特定离子或多个离子的丰度，并与已知标准物质的响应比较。LC-MS将液相色谱与质谱联用，特别适合组分复杂样品和微痕量样品的分离分析。在中药成分分析、抗生素分析、体内药物分析等方面得到广泛应用。（一）液相色谱-质谱联用技术（二）气相色谱-质谱联用技术1.概念现行版《中国药典》通则增订了中药材农药残留量测定法，其中包括了用气相色谱-质谱联用技术测定74种农残，为中药材农残测定确定了分析方法，具有更好的特异性和灵敏性。2.组成气相色谱-质谱联法（GC-MS）将高效的气相色谱分离技术与能够提供丰富结构信息和专属性定量结果的质谱技术相结合，广泛应用于易挥发的或经衍生化处理后易挥发的有机物分析。（二）气相色谱-质谱联用技术GC-MS法与LC-MS法互补，已成为药物研究、生产、临床检测的重要技术手段。（二）气相色谱-质谱联用技术计算机系统用于气相色谱、接口和质谱仪的控制，同时进行数据采集和处理。质谱作为气相色谱的检测器，将分离后的各组分分别离子化、离子检测。接口把气相色谱流出的各组分导入处于真空状态的质谱仪，起着气相色谱和质谱之间适配器的作用。气相色谱仪在大气压下分离待测样品中的各组分。（二）气相色谱-质谱联用技术注意选用高纯氦气作为载气；GC-MS所用毛细管色谱柱应为MS专用柱。供试样品应采用非水溶剂溶解，浓度一般控制在ppb级。比较复杂的混合物样品一般不宜直接进样。3.注意事项（二）气相色谱-质谱联用技术样品前处理样品前处理是指在样品分析前要采用一定的方法，使待测药物纯化或待测元素转化为适宜的状态后再进行分析测定。样品前处理1.目的样品前处理消除干扰，保护仪器。提高方法的准确度、精密度、选择性和灵敏度。分析检测的关键环节。前处理对象前处理方法样品前处理含金属（Ca、Fe、Zn、Hg）卤素（F、Cl、Br、I）、N元素、P、S不经有机破坏经有机破坏样品前处理1.不经有机破坏的分析方法对药物分子的有机结构部分不进行完全破坏，通过选用适当溶剂溶解或经简单回流处理，使待测元素电离、离解，转化为无机离子进行测定，适用于含金属有机药物或结合不牢固的含卤素药物的分析。方法包括直接溶解法、提取分离法中的加热回流、超声处理、索氏提取、水蒸气蒸馏法、冷浸或渗漏法、萃取浓集法化学分解法……样品前处理2.经有机破坏的分析方法某些药品中含有机氮、硫、磷及有机金属离子与碳原子结合牢固，用上述方法难以成为无机的化合物，此时必须采用有机破坏的方法，使之转变为无机化合物，方可进行测定。样品前处理方法包括湿法破坏法和干法破坏法。破坏法2.经有机破坏的分析方法

（1）湿法破坏法1、硝酸—高氯酸方法2、硫酸—硫酸盐方法3、硝酸—硫酸法方法4、其他湿法主要采用强酸进行有机破坏，将有机结合的待测元素转变为可测定无机化合物。本法可用于生物制品中氮、磷或金属元素的测定。以硫酸-硫酸盐法为基础的含氮有机药物定量分析方法。适用于含氮有机药物前处理。例：凯氏定氮法用浓硫酸进行消解消解液加氢氧化钠蒸馏，用2%硼酸溶液吸收生成硼胺再用稀硫酸滴定2.经有机破坏的分析方法

样品前处理高温炽灼法氧瓶燃烧法2.经有机破坏的分析方法

（2）干法破坏法适用于含卤素、硫、磷等有机物的前处理，亦可用于含硒、砷盐药物的测定。样品前处理主要用于含卤素药物的鉴别。本法将有机药物经高温灼烧灰化，使有机结构分解而待测元素转化为无机元素或可溶性的无机盐。样品前处理（1）高温炽灼法将有机药物放入充满氧气的密闭烧瓶中进行燃烧，将燃烧所产生的待测物质吸收在适当吸收液中，采用适当分析方法进行鉴别、检查或含量测定。适用于含卤素及硫、磷、硒等药物的鉴别、检查和含量测定。（2）氧瓶燃烧法样品前处理2.经有机破坏的分析方法

分析方法的验证药品质量标准分析方法验证的目的是证明采用的方法适合于相应检测要求。分析方法的验证对原分析方法进行修订

建立药品质量标准AC制剂的组分变更BD

药品生产工艺变更需要进行方法验证的情况方法验证的理由、过程和结果均应记载在药品质量标准起草说明或修订说明中。分析方法的验证质量标准中需要验证的项目鉴别试验、限量或定量检查、原料药或制剂中有效成分含量测定、制剂中其他成分药品溶出度、释放度等检查中溶出量等的测定方法。准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。在分析方法验证中，须采用标准物质进行试验。分析方法的验证指标分析方法的验证一、准确度准确度系指采用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率（%）表示。准确度应在规定的范围内测定。

加样回收率测定——向已知被测成分含量的供试品中精密加入一定量的被测成分对照品，用实测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量计算回收率。

数据要求：9个测定结果，3个不同浓度，每个浓度各3份(80，100，120％)分析方法的验证在规定的条件