单核细胞增生李斯特氏菌血清分型方法

1单核细胞增生李斯特氏菌血清分型方法本标准规定了单核细胞增生李斯特氏菌的血清分型方法本标准适用于对单核细胞增生李斯特氏菌进行血清分型。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的惨改单)适用于本文件。GB4789.30食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验3.1台式离心机：1600g。3.3麦氏温度计。3.6试管：6mmx50mm3.10无菌载玻片。3.11生物安全柜。4培养基和试剂4.1SIM动力培养基：见A.1。4.2胰蛋白磷酸盐肉汤(TPB):见A.2。4.40.85%灭菌生理盐水：见A.3。4.5含0.5%甲醛的生理盐水：见A.4。4.7H抗血清。5方法提要选择经GB4789.30鉴定确证为单核细胞增生李斯特氏菌的纯培养物作为血清分型的待测菌株。2首先，使用低温(25℃)培养后具有运动性的菌株进行H抗原的鉴定；继而选用热灭活菌悬液进行0抗原的鉴定。鉴定0抗原时，可优先采用玻片法，如果玻片法凝聚反应不典型，可再用试管法进行凝集反应。最终，根据所得H抗原和0抗原的对应关系，判定待测单核细胞增生李斯特氏菌的血表1单核细胞增生李斯特氏菌血清型抗原结构A.B.c7注：圆括号中的0抗原只出现在部分对应血清裂分离株6检验流程单核细胞增生李斯特氏菌血清分型流程见图1。47.1.5重悬菌体细胞于含0.5%甲醛生理盐水(45)中，调整菌体细胞浓度≥3个麦氏单位，该菌悬液为标准菌悬液；也可以用经甲醛处理的单核细胞增生李斯特氏菌TPB菌悬液进行H抗原凝集反应，其凝集反应结果应与用0.5%甲醛生理盐水(45)洗涤的标准菌悬液相同。7.1.6在6mm×50mm试管中分别加人100μL经稀释的H抗血清(4.7),A,B,C,D,与等体积经甲醛处理的菌悬液充分混匀，同时用0.85%灭菌生理盐水(4.4)代替抗血清作为阴性对照，48℃水浴保温1h之后，用肉眼观察是否有凝集反应发生。凝集反应表现为：形成沉淀，上清液清澈。如有凝集反应发生，为阳性反应，可判定相应H抗原；如无凝集反应发生，则可判断为阴性反应。7.2.1将活化的待测菌株接种于TPB(42)液体培养基，35℃培养18h~24h,100℃加热菌悬液2h,1600g.离心30min收集菌体。如果用玻片法进行凝集反应，用TPB(4.1)液体培养基洗涤菌体细胞一次：如果用试管法进行凝集反应，用含0.5%甲醛生理盐水(45)洗涤菌体细胞一次。7.2.2玻片法：用含0.5%甲醛生理盐水(4.5)重悬菌体细胞，制成高浓度的菌悬液(菌悬液的浊度=3个麦氏单位),置25μLO抗血清(46)于灭菌玻片上，与等体积的菌体抗原充分混合，同时用25μL0.85%灭菌生理盐水(4.4)与等体积的菌体抗原混合作为阴性对照。用手握住载玻片的两边，在黑色背景的衬托下，接近灯光进行观察，如果凝聚反应不典型，用试管法进行凝集反应7.2.3试管法；鉴定0抗原的方法与鉴定H抗原的方法基本相同，所不同的是将等体积混合的0抗血清和菌体抗原，48℃保温2h后，在4℃冰箱过夜，观察凝集反应结果；或是在48℃水浴保温过夜观察凝集反应结果。8血清型结果判定根据H抗原和0抗原凝集反应结果从表1查到相应的血清型9安全措施为了保护试验室人员的安全，所有培养物和废弃物应小心处置，并按GB19489中有关规定执行。(规范性附录)A.1SIM动力培养基胰陈多价胨将上述各成分加热混匀，调pH7.2。分装小试管.121℃高压灭菌15min,备用。A.2胰蛋白磷酸盐肉汤(TPB)氯化钠5.0gA.30.85%生理