SNT 1816-2013 转基因成分检测 番茄检测方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准转基因成分检测番茄检测方法Detectionofgeneticallymodif2013-03-01发布2013-09-16实施I本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。——在常规PCR检测方法中增加了被检基因的启动子FMV35S;1本标准规定了番茄及其制品中转基因成分常规PCR和实时荧光PCR检测方法。下列文件对于本文件的应用是不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法SN/T1194植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法或实时荧光PCR,检测其中是否含有各种内、外源基因，达到对番茄及其制品中有无转基因成分的26.3试剂10×PCR缓冲液(氯化钾100mmol/L、硫酸铵160mmol/L、硫酸镁20mmol/L、Tris-HCl合附录A中表A.1和表A.2的序列合成引物和探针，加超纯水琼脂糖(电泳纯),溴化乙锭(EB),DNA分子量标准(100bp～2000bp),50×TAE电泳缓冲液酸275g/L、EDTA0.01mol/L、pH8.0),10×电泳上样缓冲液(含0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青按照SN/T1194中规定的方法执行。番茄种子或番茄叶片：经干热灭菌(150℃干热预处理2h)或或粉碎机中碾磨至样品粉末颗粒约0.5mm新鲜番茄：称取20g果肉(汁)充分匀浆后备用，或者取出种子后冷冻研磨至样品粉末颗粒约8.1样品DNA的提取等体积的三氯甲烷/异戊醇(24:1),充分混匀，室温15000g离心15min;小心吸取上清液(约600μL)至一新的1.5mL离心管，加入2.5倍体积的预冷的无水乙醇或0.8倍体积的异丙醇，再加入1/10体积的3mol/L乙酸钠(pH4.8),充分混匀，-20℃(加入无水乙醇时)或4℃(加入异丙醇时)放置330min以上；4℃,15000g离心15min,弃去上清液；加入70%的乙醇500μL,洗涤沉淀两次，室温15000g离心5min弃上清液(注意不要把沉淀倒出),晾干沉淀，至乙醇挥发殆尽后，采用市售的不同基因组DNA提取试剂盒提取番茄及其制品中的DNA,按操作说明书使用。番茄检测过程中应设置DNA提取空白对照、PCR扩增试剂空白对常规PCR引物信息见表A.1,商品化转基因番茄转入的外源基因信息见表A.3。常规PCR反应体系和反应参数见表1和表2。10×PCR缓冲液引物DNA模板注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。被检测基因扩增终延伸rbcL(内源基因)PG(内源基因)CaMV35S(外源基因的启动子)NOS(外源基因的终止子)FMV35S(外源基因的启动子)4使用番茄内源基因(rbcL基因或PG基因)片段设计的引物对供试番茄样品DNA提取液进行PCR可进行PCR测试的DNA,或DNA提取液中有抑制PCR反应的物质，应该重新提取样品DNA,直到扩8.3.2.2外源基因检测结果的判定白对照均未出现扩增条带的条件下，如果阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带(扩增片段大如果测试样品中未出现相应PCR扩增条带，而阳性对照正常，则可判定测试样品8.3.2.3确证实验——PCR产物序列分析；——实时荧光PCR检测。8.4实时荧光PCR检测8.4.1反应体系实时荧光PCR检测所用引物见表A.2实时荧光PCR反应体系见表3。终浓度10×PCR缓冲液dNTP(含dUTP)引物(上游)引物(下游)DNA模板(20ng/μL～30ng/μL)注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进58.4.2实时荧光PCR反应参数检测内源基因tRNA-Leu的实时荧光PCR反应参数为：37℃5min;预变性95℃3min;95℃15s,60℃1min,40个循环。检测内源基因LAT52的实时荧光PCR反应参数为：50℃2min;预变性95℃10min;94℃30s,检测外源基因NPTII、CaMV35S、NOS、FMV35S的实时荧光定量PCR的反应参数为：37℃5min;预变性95℃3min;95℃15s,60℃1min,40个循环。8.4.3.1基线和阈值的设置测试样品外源基因检测Ct值在36>40之间，内源基因检测20≤Ct≤36,并出现典型扩增曲线，且8.4.4结果表述该样品中未检出×××基因。该样品中检出×××基因，或：该样品是×××转基因番茄品系。9样品和数据保存根据样品的状态采用相应的保存方式，一般保存期为6个月。如检测到转基因成分，则该样品应保存1年左右，以备复验、谈判和仲裁。样品保存期满后应进行妥善处理。测试样品转基因成分检测结束后，应将原始记录单和检验报告或证书归档，并妥善保管，以备复验、谈判和仲裁。6被检测基因引物序列退火温度/℃叶绿体DNA提取效率检测5'-ttcttcgcatgtacccgcag-3’内源DNA提取效率检测5'-cgttggtgcatccctgcatgg-3’5'-tcatcccttacgtcagtggag-3’筛选检测(品系351N除外)选择其一5'-ccatcattgcgataaaggaaa-3’5’-gctcctacaaatgccatca-3’5'-gatagtgggattgtgcgtca-3’5’-gaatcctgttgccggtcttg-3’筛选检测(品系351N、8338和除外)选择其一5'-ttatcctagtttgcgcgcta-3’5'-gccggtcttgcgatgattat-3’5'-ttatcctagtttgcgcgcta-3’5'-ggatctcctgtcatct-3’筛选检测选择其一5'-gatcatcctgatcgac-3’5'-ctcaccttgctcctccgaga-3’5'-cgccttgagcctggcggacag-3’5'-ccactgacgtaagggatgacg-3’383和180°5'-ggatccttagaagcatctagt-3’检测B.Da.F5'-catcgcaagaccggcaacag-3’5'-aaacagacaaaaataggcgg-3’5'-ccaaacgtaaaacggcttg-3’5'-aagacatccaccgaacactta-3’5'-aggacagctcttttccacgtt-3’转基因番茄可同时扩增出383bp和180bp两个不同大小的DNA片段，非转基因番茄只能扩被检测基因引物序列5’标记FAM;3'标记TAMRA(除标注以外)适用范围任选其一5'-agaccacgagaacgatatttgc-3’5'HEX-ctcttgcagtcctcccttgggct-3’5’-cgacagtggtcccaaaga-3’5'-tggacccccacccacgaggagcatc-3’5'-aagacgtggttggaacgtcttc-3’筛选检测5'-aggatctcgtcgtgacccat-3’筛选检测5’-tggtecccacaagccagctgctcga-3’筛选检测、5'-aggacagctcttttccacgtt-3’5'-gcaatcctgagccaaatcc-3’品系目的基因及其调控元件目的基因筛选基因食品和饲料，1995年用于种植。加拿大1995未知水解酶(Sam-K)未知1996年批准用于食品、饲料和种植因CryIAc和氨基蛋白终1987Monsanto公司美国1998年用于食品、(ACCD)或乙烯形成酶(EFE)1994年批准用于食品和饲料，1995年用于表A.3品系